Создание трехмерной культуры глиальных клеток мозга крысы

Возьмите микропланшет с адгезивной культурой глиальных клеток, полученных из мозга крысы. Культура содержит астроциты, микроглию и олигодендроциты.

Извлеките среду, инкубируйте с ферментным раствором, чтобы отделить клетки, а затем перенесите их в пробирку.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость с клеточным мусором. Ресуспендируйте клетки в теплой среде.

Растирать с помощью шприца для разрушения клеточных комков и фильтровать с помощью ситечка для получения одноклеточной суспензии.

Добавьте фотосшиваемый биополимер, сшивающие агенты и компоненты внеклеточного матрикса.

Вылейте смесь в форму, прикрепленную к покровному стеколу. Подвергните смесь воздействию света высокой интенсивности, чтобы вызвать сшивку, образуя гель и инкапсулируя глиальные клетки.

Снимите форму и поместите покровные стекла в микропланшет. Добавьте теплую среду и инкубируйте гель в физиологических условиях.

Клетки пролиферируют в поддерживающем внеклеточном матриксе и создают клеточную сеть, создавая трехмерную культуру глиальных клеток.

За 24 часа до инкапсуляции клеток аспирируйте среду из двухнедельных первичных культур и добавьте по 1 миллилитру свежей среды в каждую лунку. В день инкапсуляции клеток приготовьте по 12,5 миллилитров разведенного трипсина и 25 миллилитров среды на каждую 12-луночную пластину, и подогрейте до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Затем с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров добавьте около 1 миллилитра разведенного трипсина в каждую лунку 12-луночного планшета.

Инкубируйте от 20 до 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока слой сливающихся клеток не отделится от пластины. После инкубации с помощью пипетки объемом 1 миллилитр извлеките оторвавшиеся клетки, которые должны выглядеть как один плавающий кусочек, и переложите в 15-миллилитровую коническую центрифужную пробирку. Разбавить эквивалентным объемом среды и центрифугировать в 200 раз г в течение 2 минут при комнатной температуре.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах теплой среды. Разотрите клетки пять раз с помощью пипетки, затем снова центрифугируйте при 200 умноженных на g в течение двух минут. После отжима сцедите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 5 миллилитрах теплой среды и переложите клетки в 50-миллилитровую коническую центрифужную трубку.

Затем с помощью 10-миллилитрового шприца с иглой 18-го калибра трижды растирают клеточный раствор и фильтруют суспензию через клеточное сито толщиной 40 микрон в новую коническую центрифужную трубку. Далее соберите 10 микролитров клеточной суспензии, разведите 1 к 100 в теплой среде, и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток.

Инкубируйте оставшиеся клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия до этапа инкапсуляции. Подогрейте 12,5 миллилитров наивной среды и 12,5 миллилитров кондиционированной среды для каждого растения 12-луночной пластиной 3D гидрогелей. Затем взвесьте 7 миллиграммов HAMA на растение 12-луночной тарелкой, и добавьте в стерильную фильтрацию в концентрации 2% от массы к объему. Ультразвуком наносите раствор в течение 60 минут с частотой 20 килогерц до полного растворения HAMA.

Во время ультразвуковой обработки готовьте индивидуальные 10% растворы TEA и NVP. Также готовят 1-миллимолярный раствор эозина в 1-миллилитровых аликвотах стерильных ПБС. Затем для каждого 12-луночного планшета сделайте окончательную смесь 1,4 1,4 миллилитра, состоящую из 1 x 10⁷ клеток, 0,5% HAMA, 20% смеси базальной пластинки в PBS, 0,1% TEA, 0,1% NVP и 0,01 миллимолярного эозина Y.

После осторожного перемешивания раствора с помощью пипетки с наконечником объемом 1 миллилитр введите 100 микролитров в каждую форму PDMS. Затем подвергните образцы воздействию зеленого светодиодного света высокой интенсивности в закрытой коробке в течение 5 минут при комнатной температуре.

Пятиминутное воздействие зеленого светодиода необходимо для формирования 3D-геля. Красный цвет, вносимый эозином Y, станет прозрачным и будет свидетельствовать о прекращении реакции.

Затем добавьте 1 миллилитр теплой, кондиционированной среды в каждую лунку 12-луночного планшета; возьмитесь за каждую покровную пластину между большим и указательным пальцами и с помощью изогнутого пинцета медленно снимите форму PDMS, не вытесняя гель. Поместите форму в лунку с кондиционированной средой.

Удаление плесени является самым сложным этапом. Это следует делать с особой осторожностью, чтобы не допустить смещения геля и разрушения покровного стекла. Для этого может потребоваться практика.

После того, как все формы будут перенесены в лунки пластины, добавьте в каждую лунку дополнительно 1 миллилитр теплой среды DMEM/F12. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение двух недель перед визуализацией.