Создание и поддержание астросфер с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:07 мин • July 8th, 2025
Начните с планшета, покрытого ВКМ, и семенных кластеров плюрипотентных стволовых клеток человека в питательной среде, содержащей ингибиторы ро-киназы.
ЭКМ усиливает прикрепление клеток, в то время как ингибиторы блокируют рокиназы, предотвращая апоптотическую гибель клеток и способствуя выживанию и пролиферации клеток.
Введите среду для нейронной дифференцировки, чтобы индуцировать дифференцировку стволовых клеток в нейральные клетки-предшественники.
Обработайте отслойочным раствором; ферменты в этом растворе ухудшают ВКМ и контакт с клетками, высвобождая клетки.
Переложите их в колбу без оболочки, содержащую ингибиторы рокиназы.
Ингибиторы способствуют выживанию клеток и спонтанной агрегации в трехмерные структуры или сфероиды.
Дополните сфероиды средой для нервной дифференцировки, богатой фактором роста, что позволит нейронным клеткам-предшественникам дифференцироваться в предшественников астроцитов и формировать астросферы.
Регулярно добавляйте раствор для разделения астросфер на более мелкие скопления. Это позволяет питательным веществам достигать внутренних клеток сфероида и поддерживать их жизнеспособность.
Поддерживайте астросферы в свежей среде, чтобы их предшественники могли созреть в астроциты.
Начните с посева кластеров hPSCs в 2 миллилитрах среды hPSC, содержащей ингибитор рокиназы Y-27632, в каждую лунку шестилуночного планшета с покрытием ECM. Поддерживайте стволовые клетки до тех пор, пока они не станут примерно на 50% сливающимися. Затем замените среду на нейронную, содержащую SP-431542 и DMH1, чтобы стимулировать нейронную индукцию.
Когда ячейки сливаются примерно на 95%, разделите каждую лунку с 1 по 6 на новые лунки с покрытием ECM. На 14-й день диссоциируйте ячейки с раствором для отслоения и перенесите содержимое каждой лунки в колбу Т-25 без покрытия со средой, содержащей Y-27632, чтобы способствовать образованию агрегатов.
Чтобы получить предшественников астроцитов и астроцитов в спонтанно сформированных 3D-агрегатах, переключитесь на нейронную среду, содержащую EGF и FGF2, и кормите каждые три-четыре дня до тех пор, пока идентичность астроцитов не будет подтверждена через четыре-шесть месяцев.
По умолчанию этот протокол производит дорсальные кортикальные астроциты. Тем не менее, подтипы астроцитов могут быть регионально определены путем добавления моделирующих морфогенов, если это необходимо.
Раз в неделю, когда появляются темные центры, собирайте сферы центрифугированием, затем аккуратно диссоциируйте H-астроагрегаты раствором для отслойки. Реплицируйте только те сферы, которые не прикрепляются спонтанно, чтобы избежать пропускания клеток, не относящихся к ЦНС и нервам.
Обзор
В данной статье представлен протокол дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в предшественники астроцитов и астроциты с использованием ингибиторов Rho-киназы и среды для нейральной дифференцировки. Процесс включает посев стволовых клеток, индукцию дифференцировки и поддержание жизнеспособности клеток с помощью специфических обработок.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология стволовых клеток
- Дифференцировка клеток
Общая информация
- Плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs) могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Ингибиторы Rho-киназы используются для повышения выживаемости и пролиферации клеток.
- Астроциты играют критически важную роль в центральной нервной системе.
- Системы 3D-культивирования позволяют улучшить межклеточные взаимодействия и функциональность клеток.
Цель исследования
- Разработать надежный метод получения предшественников астроцитов из чПСК.
- Изучить влияние ингибиторов Rho-киназы на выживаемость и дифференцировку клеток.
- Разработать протокол получения астроцитов in vitro для исследовательских целей.
Используемые методы
- Посев чПСК на планшеты, покрытые внеклеточным матриксом (ECM), с использованием ингибиторов Rho-киназы.
- Индукция дифференцировки с помощью нейральной среды.
- Использование раствора для отсоединения клеток с целью их высвобождения для дальнейшего культивирования.
- Поддержание клеток в среде, обогащенной факторами роста, для стимуляции созревания.
Основные результаты
- Успешно получены предшественники астроцитов из hPSCs.
- Продемонстрирована важность ингибиторов Rho-киназы для выживаемости клеток.
- Разработан протокол получения астроцитов в форме 3D-агрегатов.
- Подтверждена идентичность астроцитов после нескольких месяцев культивирования.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод получения астроцитов.
- Ингибиторы Rho-киназы имеют решающее значение для повышения жизнеспособности клеток.
- Системы 3D-культивирования способствуют лучшему развитию и функционированию клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет получать астроциты человека из плюрипотентных стволовых клеток, обеспечивая возобновляемую, релевантную человеку систему для нейробиологических исследований. 3D-модель астросфер поддерживает изучение механизмов глиально-нейрональных взаимодействий и функций гематоэнцефалического барьера. Моделирование физиологии астроцитов человека in vitro обеспечивает прогностическую ценность для валидации мишеней при разработке препаратов для лечения заболеваний ЦНС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы нейровоспаления и нейродегенерации, опосредованные астроцитами.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемый источник астроцитов человека для анализа взаимодействия с мишенями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: способствует разработке фенотипических скринингов с участием глии для поиска соединений, активных в ЦНС.
- Практическая ценность: астросферы можно диссоциировать и пересеивать для поддержания пула клеток-предшественников для высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет проводить моделирование соответствующих заболеваний при использовании в сочетании с иПСК, полученными от пациентов, или методами генетической инженерии.
- Практическая ценность: способствует снижению рисков на доклиническом этапе путем оценки влияния соединений на созревание и функции человеческих астроцитов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки — от валидации мишени до оптимизации соединений-лидеров, предоставляя клеточную систему человека для снижения механистических рисков.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о роли астроцитов в синаптической модуляции и нейротоксичности.
- Скрининг: позволяет подготовить анализы путем воспроизводимого получения сфероидов, обогащенных клетками-предшественниками.
- Аналитика: позволяет количественно оценить созревание астроцитов с помощью экспрессии маркеров и функциональных показателей.
- Трансляционные исследования: связывает дифференцировку стволовых клеток с доклинической валидацией с использованием релевантных для человека глиальных моделей.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую платформу для получения астроцитов для множества проектов и показаний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет моделирования биологии астроцитов человека в определенной, воспроизводимой системе.
- Операционная ценность: Стандартизирует получение астроцитов благодаря использованию определенных компонентов среды и стратегий пассирования.
- Стратегическая ценность: Снижает зависимость от первичных тканей человека и животных моделей, повышая этическую и логистическую эффективность.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию мишеней ЦНС с учетом рисков, используя модели патофизиологии глии человека.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, их дифференцировкой и манипуляциями с 3D-сфероидами.
- Зависит от стабильных поставок компонентов внеклеточного матрикса (ECM), ингибиторов Rho-киназы (Y-27632) и факторов роста нейронов (EGF, FGF2).
- Необходима длительная поддержка культуры (4–6 месяцев) для полного созревания астроцитов.
- Требуется адаптация протокола при моделировании регион-специфических астроцитов с использованием морфогенов паттернирования.
- Ограничена отсутствием микроглии и сосудистых компонентов в текущем формате сфероидов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты
Похожие видео
0 Просмотры
Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и культура взрослых данио мозга, полученных из нейросферах
Похожие видео
0 Просмотры
Дифференцировка нетрансгенных и трансгенных плюрипотентных стволовых клеток человека в нейральные клетки-предшественники
Похожие видео
0 Просмотры
Генерация 3D сфер совместного культивирования астроцитов и нейронов для индуцирования образования синапсов
Похожие видео
0 Просмотры
Получение сфероидов из плюрипотентных стволовых клеток человека
Похожие видео
0 Просмотры
Генерация Myospheres Из ЭСК эпигенетическими Перепрограммирование
Похожие видео
0 Просмотры
Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы
Похожие видео
0 Просмотры
Моделирование синаптических микросхемы с 3D Cocultures астроциты и нейроны от человеческих плюрипотентных стволовых клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Сыворотка Бесплатное производство трехмерных человеческих гепатосфер из плюрипотентных стволовых клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026