Дифференцировка нетрансгенных и трансгенных плюрипотентных стволовых клеток человека в нейральные клетки-предшественники

Возьмите многолуночный планшет, покрытый внеклеточным матриксом, или ВКМ.

В отдельные лунки введите нетрансгенные и трансгенные плюрипотентные стволовые клетки человека, или hPSCs, в культуральную среду.

Трансгенные ПСК несут трансген под антибиотик-индуцируемым промотором. Трансген кодирует транскрипционный фактор, который индуцирует нейронную дифференцировку.

Инкубируйте для облегчения адгезии клеток к ВКМ. Малые молекулы в среде препятствуют апоптозу, способствуя пролиферации клеток.

Добавьте раствор для отслойки клеток; добавьте среду, чтобы остановить диссоциацию, а затем перенесите их на другую микропластину с покрытием ECM, чтобы обеспечить пролиферацию клеток.

Введите нейродифференцировочную среду, содержащую малые молекулы, в нетрансгенные клетки и антибиотик-индуктор в трансгенные клетки.

Малые молекулы побуждают нетрансгенные клетки дифференцироваться в нейральные клетки-предшественники или NPC. В трансгенных клетках индуцированная антибиотиками экспрессия транскрипционного фактора активирует гены, необходимые для дифференцировки в NPC.

Поддерживайте NPC в культуре для последующих применений.

Для получения нетрансгенных нейронных предшественников и нейронов, или hNeurons, см. Нейронные предшественники, полученные из hPSC, на 14-й день в шестилуночных планшетах с покрытием ECM с 2 миллилитрами нейронной среды и Y27632 на лунку.

При работе с доксициклин-индуцируемыми iNeuron добавляйте нейронную среду, содержащую доксициклин, когда клетки сливаются примерно на 35%, чтобы вызвать дифференцировку и активировать экспрессию генов. Через два дня подкармливайте трансгенные и нетрансгенные линии по 2 миллилитра нейронных сред на лунку в день. Продолжайте до тех пор, пока клетки не будут готовы к подъему при 70% конфлюенции.