Получение шванновских клеток, подобных клеткам, из стромальных клеток костного мозга

Начните с адгезивной культуры стромальных клеток костного мозга.

Подвергайте клетки гипоксии, состоянию, характеризующемуся снижением уровня кислорода, в течение необходимого времени.

Изолируйте клетки, предварительно подготовленные к гипоксии, затем центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в нейрональных средах-предшественниках, содержащих факторы роста нейронов.

Перенесите клетки в культуральную тарелку с низким уровнем прикрепления и инкубируйте.

Гипоксия-прекондиционирование и факторы роста нейронов индуцируют дифференцировку стромальных клеток в предшественников нейронов.

Поверхность пластины с низким уровнем прикрепления поддерживает предшественников во взвешенном состоянии, способствуя их пролиферации и агрегации в трехмерные нейросферы.

Соберите нейросферы, центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в глиальных индукционных средах, содержащих глиа-специфические факторы роста.

Перенесите нейросферы в культуральную пластину, покрытую ламинином, компонентом внеклеточного матрикса, и поли-D-лизином, положительно заряженным синтетическим полимером.

Покрытая поверхность способствует адгезии клеток, облегчая прикрепление нейросферы.

Глиа-специфичные факторы роста стимулируют дифференцировку нейрональных предшественников в шванновские клетки, которые демонстрируют характерную коническую морфологию шванновских клеток.

Для предварительного кондиционирования при гипоксии сначала отпустите кольцевой зажим и очистите открытые части 70% этанолом. Далее разобрать камеру гипоксии на составляющие и поместить их в ламинарный проточный колпак для стерилизации под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.

Затем промойте культуру от 80% до 90% конфлюентной МСК с 10 мл PBS, как показано выше, и обработайте культуры свежей питательной средой МСК с добавлением 25 миллимолярных HEPES. Поместите обработанную культуру в собранную камеру гипоксии и затяните кольцевой зажим. Загерметизируйте соединительные концы камеры, чтобы убедиться в отсутствии утечки газа, и промойте в камеру газовую смесь из 99% азота и 1% кислорода со скоростью расхода 10 литров в минуту.

Через пять минут поместите камеру в инкубатор для клеточных культур на 16 часов. На следующее утро отделите клетки, как показано выше, и соберите их центрифугированием. Ресуспендируйте гранулу в среде нейропредшественника и семенах 6 x 10 3 клеток на квадратный сантиметр на шестилуночные планшеты с низким уровнем прикрепления для их культивирования при 37 градусах Цельсия и 5%_CO2 в течение 12 дней.

Значительные неадгезивные сферы клеток должны наблюдаться к 6-7-му дню, при этом большее количество нейросфер проявляется в культурах, обусловленных гипоксией, чем при нормоксиии к 10-12 дням. На 12-й день с помощью 10-миллилитровой пипетки перенесите нейросферы в 15-миллилитровую коническую трубку и соберите нейросферы с помощью центрифугирования.

Ресуспендируйте сферы в DMEM/F12 и планшете от 5 до 10 нейросфер на квадратный сантиметр на покрытые поли-D-лизином ламинином шестилуночные планшеты в дозе 1,5 миллилитра глиальной индукционной среды на лунку. Выдерживайте культуру сферических клеток не менее семи дней, обновляя среду каждые три дня.