$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмите спинной мозг эмбриона крысы с прикрепленными ганглиями дорсальных корешков, или DRG, содержащими нейроны и глиальные клетки.
Отсоедините отдельные DRG от шнура, перенесите их в пробирку и центрифугируйте, отбросив остатки ткани.
Добавьте ферменты для диссоциации нейронов DRG и глиальных клеток.
Раскрутите ячейки вниз и удалите любой мусор. Добавьте питательную среду для нейронов и растирайте для получения суспензии одиночных клеток.
Перенесите суспензию в микропланшет, покрытый культуральным субстратом, способствующим адгезии клеток.
Введите очистительную среду и инкубируйте. Ингибирующие агенты среды устраняют делящиеся глиальные клетки, в то время как неделящиеся нейроны выживают.
Возьмем шванновские клеточные клетки, или МРЛ, в среде для совместного культивирования. МРЛ, предшественники шванновских клеток, взаимодействуют с эмбриональными периферическими нервными нейронами.
Введите суспензию на нейроны DRG и инкубируйте. Взаимодействие МРЛ с нейронами DRG способствует их созреванию в шванновские клетки.
Сгенерированные шванновские ячейки готовы к анализу.
Чтобы собрать ганглии дорсального корня, перенесите первый эмбрион в 10-сантиметровую чашку для культивирования, содержащую PBS комнатной температуры, под препарирующий микроскоп в положении лежа и вставьте микрорассекающие щипцы по обе стороны спинного мозга.
С помощью тупого рассечения отделите спинной мозг от окружающих мягких тканей, с помощью щипцов иссекайте спинной мозг вдоль отверстия шеи и хвостового отрезка. Удалите остаточные мягкие ткани из освобожденного спинного мозга до тех пор, пока не останутся только спинной мозг, нервные корешки и прикрепленный ганглий дорсального корешка.
Отделите отдельные ганглии дорсальных корешков от их соединительных нервных корешков. Затем с помощью ручки-пипетки, оснащенной наконечником для пипетки объемом 1 миллилитров, перенесите до 100 ганглиев дорсальных корешков в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку PBS.
Соберите ганглии центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах рекомбинантного реагента для диссоциации ферментативных клеток на пробирку. Через 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия снова центрифугируйте ганглии заднего корешка с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров, чтобы аккуратно растирать гранулы в среде для поддержания постганглионарных нейронов дорсального корня.
Засейте ганглиозные клетки дорсального корешка в соотношении 5 x 103 клеток на квадратный сантиметр в шестилуночные планшеты, покрытые ламинином Poly-D-лизина, в 1,5 мл среды для поддержания нейронов ганглиозных нейронов дорсального корешка в каждой лунке.
После двух дней в культуре при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 промойте клетки и верните культуры нейрональных клеток в инкубатор в свежей среде для очистки нейронов ганглиозов дорсального корня еще на два дня.
После 3-4 циклов поддержания и очистки культуры ганглиозных клеток дорсального корешка должны дать положительный результат на нейрональный маркер Tuj-1 и отрицательный результат на маркер глиальных клеток S100 beta.
На 7-й день шванновской клеточной культуры промывают клетки в PBS с последующей диссоциацией 0,5 мл рекомбинантного реагента для ферментативной диссоциации клеток в лунку при 37 градусах Цельсия в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в среде для совместной культивирования и высадите шванновские клетки, подобные им, на очищенную культуру ганглиозных нейронов дорсального корешка в соотношении 1 x 10,3 клетки на квадратный сантиметр в течение 14 дней совместного культивирования при 37 градусах Цельсия и 5%CO2.