Реллирование дифференцированных нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

Начните с большой культуральной пластины, содержащей дифференцированные нейроны, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, с плотной нейронной сетью.

Инкубируйте эти нейроны с помощью мягких протеолитических ферментов, чтобы отделить их от пластины, подняв их как лист.

При продолжении инкубации ферменты частично нарушают клеточные связи, ослабляя нейронные сети.

Добавьте питательную среду, чтобы остановить активность фермента.

Многократно пипетируйте оторвавшиеся нейроны, чтобы отделить их друг от друга.

Отфильтруйте нейроны через клеточный фильтр, чтобы удалить клеточные скопления и собрать отдельные нейроны.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте их в питательной среде.

Для повторного покрытия эти нейроны помещаются на полимер и многолуночную пластину, покрытую адгезионным белком. Высиживайте яйца, чтобы обеспечить их прикрепление.

Нейроны используют питательные вещества из среды, чтобы оставаться жизнеспособными. Регулярно заменяйте питательную среду для поддержания уровня питательных веществ.

Инкубируйте дальше, чтобы обеспечить созревание нейронов и формирование связей между ними.

Начните с аккуратного промывания пластины дифференцированных нейронов с помощью PBS. Диспергируйте PBS вниз по стенке пластины, а не непосредственно на ячейки, чтобы не нарушить их. Отсасывайте PBS от края чашки, наклоняя ее, стараясь не касаться клеток.

Внесите не менее 1 миллилитра протеолитического фермента на 10-сантиметровую пластину, и верните клетки в инкубатор на 40 – 45 минут. Во время инкубации проверяйте нейроны на фазово-контрастном микроскопе и продолжайте лечение протеазой до тех пор, пока нейронная сеть полностью не отделится от пластины и не начнет распадаться. Когда нейроны отсоединились, остановите пищеварение, добавив 5 миллилитров свежей среды DMEM на каждый 1 миллилитр протеазы.

С помощью серологической пипетки аккуратно растирайте клетки относительно планшета от 5 до 8 раз, стараясь не оказывать слишком большого давления. Процедите клетки через 100-микрометровую ячейку в 50-миллилитровую коническую пробирку по каплям и промойте сетчатое фильтр еще 5 миллилитрами свежей среды DMEM.

Используйте настольную центрифугу для вращения ячеек со скоростью 1000 раз больше g в течение 5 минут. После центрифугирования верните коническую пробирку в шкаф биобезопасности и отсадите большую часть среды, оставив 250 микролитров для поддержания клеток во влажном состоянии. Аккуратно ресуспендируйте клетки в 2 миллилитрах свежей среды DMEM, и пропустите их через конец серологической пипетки объемом 5 миллилитров.

Наконец, переверните трубку от 2 до трех раз. С помощью гемоцитометра и трипана синего подсчитывают жизнеспособные клетки, а затем разбавляют клетки свежим DMEM до нужной концентрации. Добавьте в пробирку соответствующие добавки в зависимости от требований конкретной клеточной линии и аккуратно перемешайте клетки, наклонив коническую трубку от 2 до 3 раз.

Нанесите покрытие из аспирата ламинина из 24-луночного планшета и промойте его один раз PBS. Отсадите PBS и нанесите раствор ячейки в каждую лунку движением в виде восьмерки, чтобы избежать комкования. Когда закончит покрытие ячеек, верните тарелку в инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.