Разработка моторных нервных органоидов человека, полученных из iPSC, с использованием микрофлюидного чипа

Возьмем, к примеру, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, или ИПСК в богатой питательными веществами среде стволовых клеток с ингибиторами ро-киназы.

Ингибиторы проникают в клетки и блокируют ферменты ро-киназы, предотвращая апоптотическую гибель клеток.

Клетки используют питательные вещества для пролиферации и спонтанной агрегации, образуя трехмерный клеточный кластер, называемый сфероидом.

Постепенно заменяйте среду на среду нейронной индукции. Сигнальные модуляторы из среды стимулируют дифференцировку стволовых клеток в нервные клетки.

Замените ее нервной средой, богатой фактором роста, чтобы дифференцировать сфероидные клетки в моторные нейроны и сформировать сфероид моторных нейронов или MNS.

Перенесите эти MNS на микрофлюидный чип с полимерным покрытием, содержащий среду для созревания.

Факторы роста нервов в среде стимулируют аксоны или более длинные проекции нейронов расти из сфероида и распространяться по микроканалу чипа.

Так образуется органоид двигательного нерва, трехмерная модель двигательной нервной ткани.

Чтобы индуцировать дифференцировку 3D iPS-клеток в моторные нейроны, засейте 4 x 10⁴ iPS-клеток на лунку в соответствующее количество лунок 96-луночного U-образного планшета в 100 микролитры питательной и бессывороточной клеточной питательной среды с добавлением 10 микромоляров Y27632.

На следующий день замените надосадочную жидкость в каждой лунке на 100 микролитров среды КСР с добавлением 10 микромоляров SB-431542 и 100 наномоляров LDN-193189. На 2 и 3 день замените надосадочную жидкость на 100 микролитров среды KSR с добавлением 10 микромоляров SB-431542, 100 наномоляров LDN-193189, 5 микромоляров DAPT, 5 микромоляров SU-5402, 1 микромолярной ретиноевой кислоты и одного микромолярного разглаженного агониста. На 4 и 5 день замените надосадочную жидкость смесью из 75% среды KSR и 25% среды N2, дополненной 10 микромолярами SP-431542, 100 наномолярами LDN-193189, 5 микромолярами DAPT, 5 микромолярами SU-5402, 1 микромолярной ретиноевой кислотой и 1 микромолярным разглаженным агонистом.

На 6 и 7 день замените надосадочную жидкость смесью 50% среды KSR и 50% среды N2 с добавлением 5 микромоляров DAPT, 5 микромоляров SU-5402, 1 микромолярной ретиноевой кислоты и 1 микромольного разглаженного агониста. На 8-й и 9-й день замените надосадочную жидкость смесью из 25% среды KSR и 75% среды N2 с добавлением 5 микромоляров DAPT, 5 микромоляров SU-5402, 1 микромолярной ретиноевой кислоты и 1 микромольного разглаженного агониста. На 10 и 11 день замените надосадочную жидкость средой N2 с добавлением 5 микромоляров DAPT, 5 микромоляров SU-5402, 1 микромолярной ретиноевой кислоты и 1 микромольного разглаженного агониста. На 12-й день замените надосадочную жидкость в каждой лунке на 100 микролитров среды для созревания, добавив 20 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора мозга на лунку.

Чтобы вызвать образование органоидов моторных нервов, замените раствор покрытия в чипе PDMS на 150 микролитров среды созревания с добавлением 20 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора, полученного из мозга, и используйте широкий наконечник микропипетки, чтобы аккуратно добавить сфероиды моторных нейронов из одной лунки 96-луночного планшета во входное отверстие микроканала чипа. Поместите небольшой резервуар со стерильной водой рядом с чипом для культуры тканей в чашку, чтобы предотвратить испарение среды, и поместите чашку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.

Каждые два-три дня заменяйте половину истощенной питательной среды из центра резервуара среды свежей средой для созревания с добавлением 20 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора мозга. Аксоны вырастают из сфероида мотонейронов в канал, спонтанно собираясь в один пучок в течение двух-трех недель, образуя органоид моторного нерва.