Генерация предшественников корковых интернейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:03 мин • July 8th, 2025
Возьмите эмбриональные стволовые клетки мыши, взвешенные в бессывороточных средах, содержащих низкомолекулярные ингибиторы.
Поместите клетки на неадгезивную культуральную пластину, позволяя им размножаться и агрегировать с образованием трехмерных эмбриоидных тел или БЭ.
Кроме того, ингибиторы блокируют ненейрональные сигнальные пути и индуцируют дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в сторону корковой нервной судьбы.
Перенесите БЭ в пробирку, центрифугу и удалите надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте БЭ в растворе, содержащем коктейль ферментов и ДНКазу.
Ферменты диссоциируют БЭ в отдельные клетки, в то время как ДНКаза разлагает загрязняющую ДНК.
Добавьте бессывороточные среды, содержащие ингибиторы, чтобы остановить ферментативную активность, затем центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, содержащую ферменты.
Ресуспендируйте клетки в средах, содержащих низкомолекулярные ингибиторы, и перенесите их на культуральные планшеты, покрытые факторами адгезии.
Ячейки прикрепляются к поверхности пластины с покрытием.
Ингибиторы предотвращают гибель апоптотических клеток и индуцируют клеточную дифференцировку в предшественников корковых интернейронов.
Начните выращивать клетки как эмбриоидные тела, добавив 75 000 клеток на миллилитр в среду KSRN2 в неадгезивные чашки для культивирования тканей и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия. На DD1 подготовьтесь к посадке клеток, покрыв обработанные культурой ткани чашки поли-L-лизином в течение не менее одного часа или на ночь при температуре 37 градусов Цельсия.
На DD2 аспирируйте поли-L-лизин и покройте пластины ламинином на ночь при температуре 37 градусов Цельсия. На DD3 перед началом диссоциации БЭ аспират ламинина и дайте планшетам полностью высохнуть в вытяжке для культуры тканей.
После этого перелейте БЭ со средой в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте в течение трех-четырех минут при 15-умножденной на g или пока БЭ не гранулируются. Аспирируйте среду и добавьте 3 миллилитра раствора для отслойки клеток, содержащего ДНКазу. Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
Осторожно переворачивайте трубку каждые три минуты, чтобы способствовать диссоциации БЭ. Как только БЭ перестанут быть видимыми или пройдет 15 минут, добавьте 6 миллилитров KSRN2, содержащей ДНКазу, и центрифугируйте в течение пяти минут при 200-кратном избытке. Затем поместите клетки в KSRN2, содержащие LDN193189, XAV939 и ингибитор ROCK Y27632 в соотношении от 4,5 до 5 x 10 4 клеток на квадратный сантиметр.
Обзор
В данном исследовании описывается метод дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в предшественники кортикальных интернейронов с использованием низкомолекулярных ингибиторов. Процесс включает формирование эмбриоидных тел (ЭТ) и их последующую диссоциацию на отдельные клетки для культивирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология стволовых клеток
- Дифференцировка клеток
Теоретические основы
- Эмбриональные стволовые клетки мыши могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Ингибиторы на основе малых молекул могут влиять на сигнальные пути в процессе дифференцировки.
- Кортикальные интернейроны играют важнейшую роль в функционировании мозга.
- Эмбриоиды обеспечивают трехмерную среду культивирования.
Цель исследования
- Разработать протокол получения предшественников кортикальных интернейронов из эмбриональных стволовых клеток.
- Исследовать влияние низкомолекулярных ингибиторов на дифференцировку клеток.
- Оптимизировать условия культивирования для обеспечения адгезии и роста клеток.
Используемые методы
- Эмбриональные стволовые клетки культивировали в безсывороточной среде с добавлением ингибиторов.
- Клетки высевали на неадгезивные планшеты для формирования эмбриональных тель (ЭТ).
- ЭТ диссоциировали до состояния единичных клеток с помощью коктейля ферментов и DNase.
- Клетки высевали на планшеты, покрытые адгезивным фактором, для дифференцировки.
Основные результаты
- Успешное формирование эмбриональных телец (ЭТ) из эмбриональных стволовых клеток.
- Эффективная диссоциация ЭТ до жизнеспособных одиночных клеток.
- Дифференцировка клеток в предшественники кортикальных интернейронов.
- Ингибиторы предотвратили гибель клеток и стимулировали дифференцировку.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно получать предшественники кортикальных интернейронов из эмбриональных стволовых клеток.
- Ингибиторы на основе малых молекул имеют решающее значение для стимуляции дифференцировки.
- Этот метод может быть применен для изучения развития кортикальных нейронов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет масштабируемо генерировать предшественники кортикальных интернейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши, предоставляя релевантную для заболеваний систему для изучения дисфункции тормозных нейронов при нейропсихиатрических расстройствах. Использование определенных малых молекул-ингибиторов для управления дифференцировкой позволяет механистически снизить риски при выборе терапевтических мишеней, участвующих в формировании и функционировании кортикальных цепей. Данный протокол позволяет получить воспроизводимую количественную клеточную модель, подходящую для валидации мишеней и фенотипического скрининга на ранних этапах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с развитием и функцией корковых интернейронов.
- Практическая ценность: обеспечивает возобновляемый источник релевантных для заболевания нейральных предшественников для исследований взаимодействия с мишенями.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем моделирования биологии корковых интернейронов человека в контролируемой системе in vitro.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные предшественники корковых интернейронов, подходящие для скрининга соединений и анализов модуляции путей.
- Количественные показатели: позволяет измерять эффективность дифференцировки, экспрессию маркеров и электрофизиологическое созревание в качестве зависимых переменных.
- Масштабируемость: экспансия на основе эмбриоидных тел позволяет производить количество клеток, достаточное для форматов высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Предшественники корковых интернейронов служат моделью нейроонтогенетических и психиатрических состояний, связанных с ГАМК-ергической дисфункцией.
- Трансляционная преемственность: Связывает модели на основе стволовых клеток с доклинической валидацией мишеней, регулирующих миграцию и интеграцию нейронов.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет выяснить специфические эффекты малых молекул на пути спецификации судьбы и созревания нейронов.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов разработки, обеспечивая валидацию мишени путем получения определенного типа нейронных клеток перед идентификацией ведущих соединений и доклиническим тестированием эффективности.
- Открывательная биология: облегчает проверку гипотез о генах и путях, регулирующих спецификацию и выживаемость кортикальных интернейронов.
- Скрининг: позволяет получать дифференцированные клетки со стабильной экспрессией маркеров для надежного скрининга соединений и считывания результатов модуляции мишеней.
- Аналитика: обеспечивает количественную оценку эффективности дифференцировки, выхода клеток-предшественников и активности ингибиторов в качестве ключевых показателей для принятия решений.
- Трансляционные исследования: способствует принятию решений о дальнейшем развитии исследований, предоставляя релевантную человеческую систему для оценки влияния мишеней на развитие тормозных нейронов.
- Корпоративное повторное использование: определенный протокол дифференцировки может быть стандартизирован для различных исследовательских групп и адаптирован для других подтипов нейронов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает уверенность в выборе мишени за счет понимания механизмов путей дифференцировки кортикальных интернейронов.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость производства нейральных предшественников для проведения повторных серий скрининга.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологической неопределенности при валидации нейропсихиатрических мишеней.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе эффектов в нейронной системе, релевантной конкретному заболеванию.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, нейральной дифференцировкой и использованием малых молекул.
- Необходим доступ к планшетам для неадгезивного культивирования, реагентам для энзиматической диссоциации и подложкам с адгезивным покрытием.
- Для воспроизводимой дифференцировки требуются стандартизированные концентрации ингибиторов и соблюдение временных интервалов между партиями.
- Адаптация метода для стволовых клеток человека или альтернативных нейрональных линий может потребовать оптимизации комбинаций ингибиторов.
- Ограничением является мышиное происхождение клеток, что может потребовать валидации на моделях человека для подтверждения трансляционной значимости.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Структурно-функциональные исследования в мышиных эмбриональных стволовых клеток Использование Рекомбиназа-опосредованного кассетный Обмен
Похожие видео
0 Просмотры
Нейрональная дифференциация от мыши эмбриональных стволовых клеток in vitro
Похожие видео
0 Просмотры
Дифференцировка и характеристика нейронных предшественников и нейронов из эмбриональных стволовых клеток мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Культура Мышь нейронных стволовых клеток прекурсоров
Похожие видео
0 Просмотры
Получение нейронных предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши методом висячей капли
Похожие видео
0 Просмотры
Методика получения нейральных клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Дифференциация мышиных эмбриональных стволовых клеток в корковых межнейронного прекурсоров
Похожие видео
0 Просмотры
Homochronic трансплантация межнейронного прекурсоров в раннем постнатальном мыши мозги
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляции и культуры нервных стволовых клеток эмбриона мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Трансплантация хемогенетически инженерии Кортикальный интернерерон прародителей в начале послеродовой мозг мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026