Получение нейронных предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши методом висячей капли

Примите суспензию эмбриональных стволовых клеток мыши.

Центрифугируете, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в среде для нервной дифференцировки.

Поместите капельки суспензии на внутреннюю сторону крышки тарелки для культуры.

Добавьте буфер на нижнюю пластину, чтобы капли не высыхали. Поместите крышку на нижнюю пластину, сформировав висячую каплю культуры, и инкубируйте.

Под действием силы тяжести клетки группируются и образуют трехмерные агрегаты, называемые эмбриоидными тельцами или EB.

Поместите капли в пластину, содержащую среду для дифференцировки, и инкубируйте при перемешивании для роста БЭ.

Центрифугируйте и удалите среду; ресуспендируйте БЭ в среде для дифференцировки с добавлением ретиноевой кислоты, перенесите их в культуральную тарелку и инкубируйте.

Ретиноевая кислота проникает в клетки и запускает образование транскрипционного комплекса. Комплекс индуцирует экспрессию генов, запуская дифференцировку в нейронные клетки-предшественники.

Дифференцированные EB готовы к последующему применению.

Начните с установки культуры висячих капельных клеток. Для 10-сантиметрового планшета для культивирования клеток отрегулируйте концентрацию до 500 клеток на 20 микролитров дифференцировочной среды. Приготовьте достаточное количество клеточной суспензии на 50 капель по 20 микролитров. С помощью микропипетки или пипетки-репитера поместите капли клеточной суспензии объемом 20 микролитров на крышку планшета для культивирования тканей, следя за тем, чтобы капли не располагались слишком близко друг к другу, чтобы предотвратить их слияние.

Наполните тарелку от 5 до 10 миллилитров PBS и осторожно накройте тарелку крышкой. Инкубируют культуру в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Через двое суток соберите капли с крышки, и поместите их в 10-сантиметровую суспензию клеточной культуры, заполненную 10 миллилитрами дифференцировочной среды. Затем поместите пластину на орбитальный шейкер, установленный на низкую скорость в инкубаторе. Еще через два дня центрифугируйте клетки при 200-кратном g в течение трех минут, и удалите надосадочную жидкость.

Чтобы индуцировать дифференцировку эмбриоидных тел в нейральные клетки-предшественники, ресуспендируйте клетки в дифференцировочной среде 5-микромолярной ретиноевой кислотой. Выдерживаем тарелку в течение двух суток. Затем замените меньшую половину среды свежей средой, наклонив планшет и отпиши его.