Получение нейронных предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши методом висячей капли

Примите суспензию эмбриональных стволовых клеток мыши.

Центрифугируете, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в среде для нервной дифференцировки.

Поместите капельки суспензии на внутреннюю сторону крышки тарелки для культуры.

Добавьте буфер на нижнюю пластину, чтобы капли не высыхали. Поместите крышку на нижнюю пластину, сформировав висячую каплю культуры, и инкубируйте.

Под действием силы тяжести клетки группируются и образуют трехмерные агрегаты, называемые эмбриоидными тельцами или EB.

Поместите капли в пластину, содержащую среду для дифференцировки, и инкубируйте при перемешивании для роста БЭ.

Центрифугируйте и удалите среду; ресуспендируйте БЭ в среде для дифференцировки с добавлением ретиноевой кислоты, перенесите их в культуральную тарелку и инкубируйте.

Ретиноевая кислота проникает в клетки и запускает образование транскрипционного комплекса. Комплекс индуцирует экспрессию генов, запуская дифференцировку в нейронные клетки-предшественники.

Дифференцированные EB готовы к последующему применению.

Начните с установки культуры висячих капельных клеток. Для 10-сантиметрового планшета для культивирования клеток отрегулируйте концентрацию до 500 клеток на 20 микр