Прямое перепрограммирование гемопоэтических клеток-предшественников в нейральные стволовые клетки

Начните с клеточной суспензии генетически измененных гемопоэтических клеток-предшественников.

Эти клетки экспрессируют факторы транскрипции, необходимые для их перепрограммирования в нейральные стволовые клетки. Этот процесс называется прямым перепрограммированием.

Перенесите клетки в многолуночную пластину, покрытую внеклеточным матриксом, с нейральной средой-предшественником и инкубируйте.

Внеклеточный матрикс обеспечивает трехмерный каркас для прикрепления и роста клеток.

Во время инкубации факторы транскрипции, экспрессируемые клеткой-предшественником кроветворения, инициируют последовательность молекулярных событий, которые позволяют ей трансформироваться в нейральную стволовую клетку.

Нейральная среда-предшественник содержит факторы, способствующие выживанию индуцированных нейральных стволовых клеток.

После инкубации замените эту среду свежей средой-предшественником нервной системы, чтобы способствовать размножению клеток.

Отделите ячейки с помощью скребка для ячеек.

Соберите эту суспензию и перенесите клетки в лунку, содержащую среду нейральных стволовых клеток.

Инкубация для поддержания индуцированных нейральных стволовых клеток.

Когда клетки сливаются на 30-50%, аспирируйте надосадочную жидкость и резерв, а затем добавьте по 1 миллилитру нейропрогениторной среды в каждую лунку. Чтобы сделать резервную пластину с использованием сфер в надосадочной жидкости, центрифугируйте резервную надосадочную жидкость при 170-кратном g в течение 10 минут.

Затем аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в нейральной среде-предшественнике. Планшет в 24-луночном планшете с матригельным покрытием; Меняйте среду в каждой пластине клеток через день до тех пор, пока клетки не достигнут от 60% до 80% слияния, обычно через одну неделю.

Как только клетки достигнут необходимого слияния, аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 1 миллилитр среды нейральных стволовых клеток в каждую лунку. Затем диссоциируйте клетки с помощью скребка для клеток с последующим очень аккуратным пипетированием.

Затем перенесите ячейки из одной лунки 24-луночного планшета в одну лунку 6-луночного планшета. Добавьте в лунку еще один миллилитр среды, и после повторения процедуры для всех лунок поместите 6-луночный планшет в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

Меняйте полный объем среды через день до тех пор, пока клетки не достигнут 60% слияния. После каждого раза диссоциируйте и возвращайте клетки в соотношении 1 к 3, как показано выше.