Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:38 мин. • July 8th, 2025
Начните с адгезивной культуры индуцированных колоний нейральных клеток-предшественников, полученных из фибробластов взрослого человека в многолуночном планшете, покрытом ламинином.
Промойте колонии буфером, чтобы удалить неадгезивные клетки, затем добавьте свежий буфер.
Соскребите отдельные колонии, чтобы удалить окружающие клетки.
Переведите колонии в свежие лунки, покрытые ламинином, содержащие нейроиндукционную среду.
Механически дезагрегируйте колонии для получения одноклеточной суспензии.
Ламинин, белок внеклеточного матрикса, взаимодействует с поверхностными белками предшественников, способствуя адгезии клеток к поверхности лунки.
Добавьте низкомолекулярный ингибитор, который проникает в клетки и блокирует специфические протеинкиназы, предотвращая клеточный апоптоз.
Факторы роста и малые молекулы, присутствующие в нейроиндукционной среде, способствуют пролиферации предшественников.
Периодически заменяйте среду для восполнения питательных веществ, способствуя продолжению пролиферации предшественников.
Конфлюентная культура, или полностью покрытый клеточный слой, указывает на успешную экспансию индуцированных нейральных клеток-предшественников.
Через сутки аспирируйте ламинин из планшетов и добавьте в лунки 200 микролитров среды для нервной индукции. Промойте шестилуночные планшеты, содержащие колонии, которые нужно собрать, один раз DPBS, прежде чем добавить 2 миллилитра среды для нервной индукции на лунку шестилуночного планшета.
Механически собирайте клетки, соскребая колонии с помощью тонкой иглы, чтобы избавиться от окружающих клеток, и собирая колонии с помощью наконечников для пипеток, установленных на 200-микролитровой пипетке, рассчитанной на 50 микролитров.
Перенесите каждую колонию в одну лунку 48-луночного планшета, покрытого ламинином, и создайте одноклеточную суспензию механическим способом, пипетируя вверх и вниз 10 раз. Добавьте к клеткам ингибитор рокиназы в конечной концентрации 10 микромоляров. Выращивайте клетки на 48-луночной пластине при 37 градусах Цельсия, 5%CO2 в течение двух дней. Меняйте среду каждые два дня до тех пор, пока клетки не достигнут слияния от 80% до 90%.