Методика получения нейральных клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши

Возьмите эмбриональные стволовые клетки мыши, или мЭСК, суспендированные в среде для дифференцировки, и инкубируйте.

В суспензионной культуре mESCs агрегируются с образованием структуры, называемой эмбриоидными тельцами или EB.

БЭ представляют собой трехмерные агрегаты, которые имитируют развивающийся эмбрион и могут дифференцироваться в нервные клетки.

Переложите EB в трубку и дайте им осесть под действием силы тяжести.

Удалите истощенную питательными веществами среду, повторно суспендируйте БЭ в свежей среде и перенесите их в чашку для культивирования.

Инкубируйте культуру суспензии, чтобы способствовать росту БЭ.

Перенесите взвешенные в среде ЭБ на многолуночную пластину. Лунки покрыты белком адгезии, что позволяет прикреплять БЭ.

Вводят ретиноевую кислоту, которая поступает в клетки и запускает образование транскрипционного комплекса.

Комплекс индуцирует экспрессию генов, способствуя дифференцировке клеток в нейральные клетки-предшественники, или NPC, которые демонстрируют расширенные клеточные процессы.

Добавьте 1,5 миллиона эмбриональных стволовых клеток мыши в неадгезивную бактериальную чашку в 10 миллилитров базальной среды для дифференцировки и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить образование эмбриоидного тела.

Через два дня переложите агрегаты клеток в 15-миллилитровые центрифужные пробирки и дайте им отстояться под действием силы тяжести. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 миллилитров свежей среды базальной дифференцировки для ресуспендирования эмбриоидных тел. Затем пересадите их в новую неадгезивную посуду и выдержите еще два дня.

Соберите и засейте около 50 эмбриоидных тел в 2 миллилитрах базальной дифференцировочной среды на лунку на шестилуночный планшет, покрытый желатином. Для индукции ретиноевой кислоты добавьте 2 микролитра запаса RHA в каждую лунку до конечной концентрации 1 микромоляр. Верните планшет в инкубатор и дифференцируйте клетки еще четыре дня.