Модифицированный метод роликовой трубки для долгосрочного культивирования срезов мозга грызунов

Возьмем срезы мозга, полученные из мозга грызуна. Срезы состоят из гиппокампа, в котором находятся нейроны гиппокампа.

Переложите срезы мозга в покровные листы, содержащие куриную плазму.

Нанесите на срезы плазму, смешанную с тромбином. Тромбин индуцирует коагуляцию плазмы, создавая биологический каркас, способствующий адгезии срезов к покровным стеклам.

Возьмите плоские роликовые трубки с отверстием на плоской стороне и клеевым диском, прикрепленным вокруг отверстия с внешней стороны трубок.

Расположите покровные стекла на клейких дисках так, чтобы срезы мозга были обращены к внутренней части пробирок.

Добавьте в пробирки питательную среду для нейронов и влейте смесь углекислого газа и воздуха.

Закройте пробирки крышками, вставьте их в роликовую решетку и инкубируйте их вращательными движениями.

Аэрация, обеспечиваемая скользящей инкубацией, и питательные вещества среды поддерживают долгосрочное культивирование срезов мозга.

Для начала подготовьте штатив для роликовых труб и сделайте приспособление, которое поможет просверлить отверстие в роликовых трубах, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. С помощью приспособления удерживайте на месте плоскую пластиковую пробирку для культивирования размером 1 сантиметр так, чтобы плоской стороной было обращено вверх. Затем просверлите отверстие диаметром 6 миллиметров с центром в 1 сантиметре от дна и по центру между сторонами трубы.

С помощью поворотного инструмента для снятия заусенцев сгладьте края отверстия и сделайте четыре канавки на внутреннем крае отверстия, чтобы облегчить дренаж отверстия во время вращения. Далее промойте пробирки 70% этанолом, а затем высушите их на воздухе в шкафу биологической безопасности. Простерилизуйте трубки в каких-нибудь 12-миллиметровых перфорированных клеевых силиконовых резиновых дисках в течение 40 минут под ультрафиолетовой лампой.

Через 20 минут переместите трубки и диски так, чтобы все открытые поверхности были стерилизованы. Далее снимите белую подложку с клеевого диска. Совместите отверстия и прикрепите силиконовую резину к внешней стороне трубки.

После того, как ломтики будут получены, поместите 2 микролитра куриной плазмы в центр фототравленой стороны подготовленного покровного стекла. Слегка распределите плазму, чтобы получить пятно диаметром от 3 до 4 миллиметров. Затем с помощью стерильного шпателя с узким концом поднимите подготовленный срез мозга. Используйте закрытые щипцы, чтобы удерживать срез на кончике шпателя во время подъема среза. Прикоснитесь шпателем к пятну плазмы на покровном листе и закрытыми щипцами надавите на срез на покровный лист.

Добавьте тонкий слой куриной плазмы на покровную крышку перед размещением среза и минимальное количество обработанной тромбином плазмы, чтобы покрыть срез. Если срез плавает, он не останется прилипшим после удаления сгустка.

Далее смешайте в отдельной пробирке 2,5 микролитра плазмы и 2,5 микролитра тромбина. Быстро нанесите 2,5 микролитра этой смеси на ломтик и аккуратно перемешайте его пипеткой вверх и вниз. Снимите прозрачное пластиковое покрытие с открытой стороны силиконового каучукового клея, ранее прикрепленного к роликовой трубе. Затем поместите покровный лист со срезом мозга на клей, выровняв срез в отверстии.

Чтобы обеспечить адгезию, мягко равномерно надавите на покровное стекло большим пальцем, равномерно надавливая на покровное стекло и удерживая его около 1 минуты, перекладывая его в шкаф биологической безопасности.

Давление на покровное стекло, чтобы приклеить его к трубке без утечки, должно быть правильным и поддерживаться достаточно долго, чтобы исключить воздушные каналы в герметике. Слишком большое давление приведет к тому, что покровное стекло треснет.

В шкаф биологической безопасности добавьте 0,8 миллилитра полной питательной среды для нейробазала А в каждую пробирку. Затем пропустите смесь из 5% углекислого газа и 95% воздуха через стерильную пастбищную пипетку, закупоренную хлопком, надежно удерживаемую зажимом. Используйте его для промывки трубки ролика газовой смесью и быстрого закрытия трубки по мере ее извлечения из пипетки.

Затем наклейте на пробирки номер среза и номер штатива. Вставьте трубки в роликовый решетку, убедившись, что они геометрически сбалансированы. Если есть нечетное количество трубок, добавьте пустые трубки для баланса.

Поместите штативы в роликовый инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия с роликами, поворачивающими роликовый стеллаж, чтобы среда оставалась на дне пробирок. Наклоните инкубатор назад примерно на 5 градусов, подняв его переднюю часть на доску.