Инициирование быстрого удлинения нейритов и формирование функциональных нейронных связей

Начните со сборки микрофлюидного устройства, содержащего микроканалы, внутри чашки, покрытой лизином.

Засейте эмбриональные нейроны питательной средой в микрофлюидные лунки, позволяя им протекать по микроканалам.

Инкубируются для облегчения прикрепления и роста нейронов, формируя физически изолированные популяции нейронов.

Разберите установку и поместите чашку в камеру микроманипулятора с солевым раствором для поддержания жизнеспособности клеток.

Введите покрытые лизином шарики рядом с нейронами, что позволит нейритам или клеточным проекциям прикрепляться и образовывать комплексы бусин-нейриты.

С помощью микроманипулятора примените всасывание для зацепления шарико-нейритового комплекса из одного канала.

Потяните этот комплекс, чтобы вызвать механическое напряжение, приводящее к быстрому растяжению нейритов.

Направьте его к другому комплексу бусин-нейрон и удерживайте его с помощью второго микроманипулятора.

Держите обе бусины на месте, чтобы облегчить образование нейритного соединения.

Выпустите всасывающую жидкость и замените физиологический раствор питательной средой.

Инкубируйте для установления функциональных связей между нейронами, способствуя коммуникации через нейротрансмиттеры.

Удалите среду из верхних лунок микрофлюидных аппаратов, не опорожняя лунки. Затем добавьте 20 микролитров концентрированного клеточного раствора в верхнюю правую лунку микрофлюидного устройства и проверьте в микроскоп, как клетки протекают внутри микрофлюидного устройства с одной популяцией.

Чтобы наложить клетки в устройство с несколькими популяциями, добавьте по 20 микролитров концентрированного клеточного раствора в каждую из верхних лунок. Под микроскопом проверьте, находятся ли клетки внутри камер. После этого поместите устройства в инкубатор на 15-30 минут, чтобы способствовать прикреплению клеток к субстрату.

После того как клетки прикрепятся к субстрату, добавьте 40 микролитров NBM в две верхние лунки устройства с одной популяцией. Это поможет удалить пузырьки воздуха из микроканалов. Добавьте 20 микролитров NBM в верхние лунки устройства для множественных популяций, в те же лунки, куда были введены клетки. Среда должна немного выступать, чтобы сформировать положительный мениск и придать лункам вид кекса.

За один-два дня до демонтажа микрофлюидных устройств добавьте 2 миллилитра предварительно подогретого NBM в каждую чашку для образца и залейте камеры. Затем держите устройства в инкубаторе. Затем используйте стерильный пинцет и наконечник для пипетки, чтобы удалить микрофлюидные устройства из покровных стекол, оставляя узорчатую конфигурацию нейронов.

При этом добавьте от 40 до 60 микролитров подготовленных гранул, покрытых PDL-покрытием, в культуру клеток. Затем верните образец в инкубатор на один час, чтобы способствовать образованию синаптических контактов. Затем установите образец в экспериментальную установку таким образом, чтобы клетки можно было оценить сверху с помощью двух микропипеток, а также получить оптический доступ. В этой конфигурации ПЗС-камера расположена на боковом порту микроскопа для захвата изображений. Подсоедините каждую пипетку, наполненную физиологическим раствором, к шприцу объемом 1 миллилитров. Затем перфузируйте образец физиологическим раствором.

Затем под микроскопом проверьте расстояние между двумя изолированными популяциями нейронов, чтобы убедиться, что эти две популяции не связаны естественным образом. Выберите бусину PDL, которая не прикреплена к нейрону в поле зрения. Совместите бусину с наконечником микропипетки, сосредоточившись на бусине, а затем на микропипетке.

Впоследствии опустите кончик как можно ближе к бусине, наблюдая за ней через микроскоп. Затем приложите отрицательное давление к пипетке, чтобы захватить шарик, и поддерживайте отрицательное давление на протяжении всего эксперимента.

Теперь выберите шарик PDL, прикрепленный к нейрону в поле зрения, и прикрепите его ко второй микропипетке с помощью отсасывания. Потяните комплекс PDL-бусина-нейрон, медленно перемещая либо микроманипулятор, либо предметный столик образца со скоростью 0,5 микрометра в минуту на 1 микрометр, и сделайте паузу на пять минут, чтобы дать возможность инициировать нейрит.

Потяните комплекс PDL-бусина-нейрон, медленно перемещая его в поперечном направлении со скоростью 0,5 микрометра в минуту на 2 микрометра. Затем сделайте паузу на пять минут, чтобы дать возможность удлинению нейритов. После успешного начала и удлинения нейрита в течение первых 5 микрометров непрерывно вытягивайте нейрит со скоростью 20 микрометров в минуту.

Чтобы соединить нейроны, выберите участок, богатый нейритами. С помощью других шариков измерьте высоту наконечника пипетки над покровным стеклом и опустите комплекс гранул PDL-нейритов так, чтобы он физически контактировал с нейритами. Оставьте комплекс гранул-нейрит PDL в контакте с целевым нейритом, одновременно манипулируя второй микропипеткой. Затем опустите вторую пипетку со вторым шариком PDL поверх вновь образованного нейрита примерно в 20 микрометрах от первого шарика и используйте второй шарик PDL, чтобы протолкнуть новую нить нейрита к целевой ячейке.

Далее удерживайте обе бусины на месте не менее одного часа. Убедитесь в отсутствии очагового вздутия, утолщения нейритов, контактирующих с бусиной с микроскопом. В течение этого времени медленно меняйте среду образца с физиологического раствора на предварительно подогретый НБМ, уравновешенный углекислым газом.

Освободите шарик от второй пипетки, отпустив всасывание. Если новый нейрит остается прикрепленным, отпустите и первую скорость. После этого осторожно поместите образец обратно в инкубатор, чтобы укрепить нейронную связь для будущих экспериментов.