Создание и поддержание культур среза из ткани глиобластомы человека

Возьмем, к примеру, ткань глиобластомы человека, первичную опухоль головного мозга, происходящую из глиальных клеток.

Промойте ткань с помощью ледяной рабочей среды, чтобы удалить остатки крови.

Разрежьте ткань на кусочки и вставьте ее в форму для заделки, содержащую расплавленный агароз.

Охладите форму, дав агарозе полимеризоваться и сформировать стабильную гелевую матрицу.

Извлеките тканевый блок из формы и закрепите его на пластине образца вибратома.

Добавьте ледяную рабочую среду, чтобы погрузить блок. Пропустите насыщенную кислородом газовую смесь для аэрации среды, поддерживая жизнеспособность тканей.

Разрежьте внедренную опухолевую ткань на тонкие ломтики.

Переложите ломтик в чашку Петри, содержащую ледяную среду для обработки, чтобы сохранить архитектуру ткани.

Затем наложите срез ткани на проницаемую мембранную вставку в лунку, содержащую среду для поддержания культуры срезов.

Поддерживайте ломтик в физиологических условиях. Культура среза готова к последующим анализам.

Начните с использования стерильных щипцов для помещения пустых вкладышей для культуры ПТФЭ в каждую лунку шестилуночного планшета, содержащего 1 миллилитр среды для поддержания культуры срезов на лунку. Когда все вкладыши будут добавлены, поместите планшет во влажный инкубатор для культуры тканей с водяной рубашкой при температуре 37 градусов Цельсия и 5%_CO2.

Затем поместите кусочки опухолевой ткани в чашку Петри, содержащую ледяную среду для обработки, и с помощью пипетки аккуратно промойте ткань три раза свежей средой, чтобы удалить любые прилипшие эритроциты. После третьего промывки с помощью скальпеля разрежьте части опухоли на полоски размером примерно 3 на 3 на 10 миллиметров, осторожно удаляя все прикрепленные сосуды и избегая некротических или прижженных тканей.

Когда вся ткань будет обрезана, добавьте от 5 до 7 миллилитров жидкой агарозы с температурой 37 градусов Цельсия в пластиковую форму размером 2 сантиметра и охладите агарозу на подушке со льдом в течение одной минуты. Поместите от 2 до 4 полосок ткани в агарозу так, чтобы длинная ось была направлена вертикально, оставив ткани на льду еще на 2-5 минут после их размещения.

Когда агароза застынет, разрежьте боковые стороны формы скальпелем, чтобы аккуратно извлечь агарозу из формы, и используйте щедрую каплю цианоакрилатного клея, чтобы закрепить агарозный блок на вибратомной пластине образца.

Когда клей схватится, погрузите агарозный блок в ледяную среду для обработки и с помощью обрезанной стерильной пластиковой пипетки введите смесь с 5% CO₂ 95%_O2 в среду внутри резервуара для вибратома. Установите толщину среза вибратома от 300 до 350 микрон и отрегулируйте увеличенную скорость лезвия и амплитуду лезвия в соответствии с консистенцией ткани и характеристиками вибратома.

Получить соответствующее количество срезов в соответствии с запланированным экспериментальным анализом. Использование микрошпателя из нержавеющей стали для переноса ломтиков в чашку Петри, содержащую ледяную среду для обработки, по мере их получения. Когда все срезы будут получены, используйте микрошпатель для переноса каждого среза на одну вставку из ПТФЭ.

После инкубации от 12 до 24 часов уравновесьте новую шестилуночную пластину, содержащую свежую среду для поддержания культуры срезов, в инкубаторе для клеточных культур в течение 15 минут. Затем с помощью стерильных щипцов захватите каждую вставку за ободок и перенесите вставки в отдельные лунки нового шестилуночного планшета.