Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:13 мин. • July 8th, 2025
Возьмите суспензию астроцитов.
Добавьте раствор биочернил, содержащий желатин, фотосшиваемые производные желатина, фотоинициаторы, фибриноген и ламинин.
Перенесите суспензию в шприц с помощью тупой иглы.
Охладите шприц для желирования биочернилами. Подсоедините шприц к печатающей головке биопринтера.
Расположите иглу соответствующим образом к культуральной пластине. Инициируйте биопечать с заданными параметрами и дизайном.
Биочернила, содержащие астроциты, выталкиваются из иглы и послойно наносятся на пластину, образуя трехмерную структуру с захваченными астроцитами.
Подвергните биопечатную конструкцию воздействию ультрафиолета. Фотоинициатор способствует сшиванию производных желатина, повышая стабильность биоконструктов.
Лечить тромбином и ионами кальция.
Тромбин с ионами кальция превращает фибриноген в фибрин, собираясь в стабильную 3D-биополимерную сеть.
Сбросить раствор и промыть буфером, чтобы удалить сшивающие агенты.
Добавьте астроцитарную среду и инкубируйте. Ламинин способствует адгезии и распространению астроцитов, образуя трехмерную нейроноподобную ткань, богатую астроцитами.
Чтобы получить конечную концентрацию 1 х 106 клеток на миллилитр, перенесите 1 миллилитр раствора желатин-желатин-метакрилоил-фибриногена в пробирку, содержащую клетки, и гомогенизируйте путем осторожного пипетирования вверх и вниз. С помощью пипетки объемом 1000 микролитров медленно перенесите астроциты, заложенные в растворе биочернил желатин-желатин-метакрилоил-фибриноген, в пластиковый шприц объемом 5 миллилитров, избегая образования пузырьков. Подсоедините к шприцу стерильную тупую иглу 22 калибра.
Подвергните биопринтер воздействию ультрафиолетового излучения в течение 15 минут, а затем протрите биопринтер 70% этанолом. Затем подсоедините шприц к печатающей головке биопринтера, и вручную промойте биочернила, чтобы удалить оставшиеся пузырьки.
Чтобы провести биопечать, поставьте на стол биопринтера 35-миллиметровую чашку для культур. Расположите иглу на расстоянии 0,1 миллиметра от поверхности чашки для культивирования, чтобы игла могла двигаться, и нажмите кнопку «Печать». После завершения биопечати убедитесь, что шприц отошел от чашки, и закройте чашку для посева. Поместите чашку для культуры под ультрафиолетовый свет для сшивания желатина и метакрилоила.
С помощью стерильного шпателя перенесите бионапечатанную конструкцию на 24-луночный планшет, добавьте 500 микролитров раствора тромбина хлорида кальция и оставьте на 30 минут, чтобы обеспечить сшивку фибрина. После удаления сшивающего раствора промойте конструкцию 2 миллилитрами PBS. Затем замените PBS 1 миллилитром питательной среды для астроцитов. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, и меняйте среду каждые три дня.