Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 4:02 мин. • July 8th, 2025
Начнем с глиомосфер, клеточных агрегатов, полученных из опухоли головного мозга или глиобластомы.
Добавьте ферменты диссоциации. Инкубируйте для разделения клеток глиобластомы и получения одноклеточной суспензии.
Затем введите обогащенную сывороткой питательную среду, чтобы остановить активность фермента.
Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клетки.
Отфильтруйте суспензию, затем центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте клетки в гидрогелевых предшественниках, которые содержат небольшие пептиды.
Загрузите эту смесь в лунки с помощью предварительно собранной силиконовой формы, содержащей гиалуроновую кислоту.
Перемешайте раствор. Инкубируйте для обеспечения взаимодействия между гиалуроновой кислотой и предшественниками гидрогеля, образуя гидрогель, который способствует захвату клеток.
Наложите на гидрогель питательную среду для поддержания выживания клеток.
После разборки формы инкубируйте гидрогель.
Внутри гидрогеля белки адгезии на клетках взаимодействуют с предшественниками пептидами и гиалуроновой кислотой.
Это заставляет клетки образовывать небольшие кластеры и развивать трехмерную культуру.
Для начала поместите чистые сухие формы из силиконового каучука в каждую лунку 12-луночного планшета, не обработанного тканевой культурой, и с помощью чистого тупого конца наконечника пипетки приклейте формы к нижней части пластины. После проверки герметичности между формами и днищами лунок соберите диссоциированные сферы глиомы из культуры клеток глиобластомы методом центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре фермента диссоциации клеток.
Через пять минут при комнатной температуре взбалтируйте пробирку легкими постукиваниями и остановите ферментативную реакцию четырьмя миллилитрами готовой среды. Снова центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежей готовой среды перед процеживанием клеток через 70-микрометровый фильтр. Промойте сетчатый фильтр еще четырьмя миллилитрами полной среды и разделите суспензию на две аликвоты по 8 х 10 по4 ячейки на пробирку центрифуги.
Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте одну гранулу в 80 микролитрах свежеприготовленного малеимида полиэтиленгликоля, или PEG-Mal-RGD, и одну гранулу в 80 микролитрах свежеприготовленного раствора PEG-Mal-CYS на форму. Используя наконечник микропипетки с широким отверстием объемом 200 микролитров, добавьте 40 микролитров раствора гиалуроновой кислоты в каждую резиновую силиконовую форму, а затем 40 микролитров раствора клеток PEG-Mal-CYS или PEG-Mal-RGD, быстро пипетируя вверх и вниз не более 10 раз на форму для смешивания.
Из-за быстрого времени гелеобразования после смешивания двух компонентов гидрогеля важно использовать наконечник пипетки с широким отверстием, чтобы быстро и тщательно перемешать растворы. Этот шаг требует практики.
Затем поместите инкапсулированные гелем клетки в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия и 5%CO2 на 5-10 минут. В конце инкубации добавьте от 2 до 2,5 миллилитров питательной среды в каждый гель и с помощью стерильного наконечника пипетки объемом два микролитра и щипцов аккуратно отделите гели от стенок форм. Затем с помощью стерилизованных щипцов извлеките формы из лунок пластины и верните пластину в клеточный инкубатор.