Анализ выживаемости клеток Пуркинье в органотипических культурах срезов мозжечка

Начнем с мозга мышиного щенка.

Изолируйте мозжечок и получите срезы ткани соответствующей толщины.

Переложите срезы на мембранные вставки, помещенные в лунки культуральных пластин, содержащих среды.

В обработанных лунках среда содержит нейропротекторное тестовое соединение. В контрольных скважинах компаунда не хватает. Инкубировать.

В контрольных условиях клетки мозжечка Пуркинье подвергаются апоптозу, имитируя раннее постнатальное развитие in vivo.

В обработанных лунках, в зависимости от своего потенциала, соединение может защищать клетки от апоптоза.

Вымойте срезы и зафиксируйте их, чтобы сохранить клеточную целостность.

Перенесите срезы в раствор, блокирующий пермеабилизацию, чтобы проникнуть в клеточные мембраны и заблокировать неспецифические сайты связывания.

Наложение первичных антител, нацеленных на кальций-связывающий белок, специфически экспрессируемый в клетках Пуркинье.

Промойте и введите вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, нацеленные на первичные антитела.

Покрасьте ядра ДНК-связывающим красителем и смонтируйте срезы.

Используя конфокальный микроскоп, количественно оцените жизнеспособные клетки Пуркинье, чтобы определить нейропротекторный потенциал иссле