Анализ выживаемости клеток Пуркинье в органотипических культурах срезов мозжечка

Начнем с мозга мышиного щенка.

Изолируйте мозжечок и получите срезы ткани соответствующей толщины.

Переложите срезы на мембранные вставки, помещенные в лунки культуральных пластин, содержащих среды.

В обработанных лунках среда содержит нейропротекторное тестовое соединение. В контрольных скважинах компаунда не хватает. Инкубировать.

В контрольных условиях клетки мозжечка Пуркинье подвергаются апоптозу, имитируя раннее постнатальное развитие in vivo.

В обработанных лунках, в зависимости от своего потенциала, соединение может защищать клетки от апоптоза.

Вымойте срезы и зафиксируйте их, чтобы сохранить клеточную целостность.

Перенесите срезы в раствор, блокирующий пермеабилизацию, чтобы проникнуть в клеточные мембраны и заблокировать неспецифические сайты связывания.

Наложение первичных антител, нацеленных на кальций-связывающий белок, специфически экспрессируемый в клетках Пуркинье.

Промойте и введите вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, нацеленные на первичные антитела.

Покрасьте ядра ДНК-связывающим красителем и смонтируйте срезы.

Используя конфокальный микроскоп, количественно оцените жизнеспособные клетки Пуркинье, чтобы определить нейропротекторный потенциал исследуемого соединения

Чтобы извлечь мозжечок, используйте прямые перевязочные щипцы, чтобы взять голову щенка за нос, и используйте ножницы для прямых глаз, чтобы разрезать кожу головы от заднего конца латерально до средней линии. Разрежьте череп таким же образом, направив кончики ножниц наружу, чтобы не повредить мозжечок, и с помощью шпателя перенесите мозг в 60-миллиметровую посуду, содержащую холодный HBSS и 5 миллиграммов глюкозы на миллилитр

.

С помощью прямых перевязочных щипцов аккуратно рассеките мозжечок, а с помощью стерильных изогнутых тонких щипцов поместите ткань на пластиковый диск на режущем столе измельчителя тканей. Поверните режущий стол, чтобы сориентировать ткань так, чтобы можно было получить парасагиттальные срезы, и потяните ручку освобождения стола вправо, чтобы переместить режущий стол до тех пор, пока лезвие не окажется на краю ткани. Затем отрегулируйте толщину ломтика до 350 микрометров и среднюю скорость лопасти и запустите измельчитель. Когда весь мозжечок будет нарезан, выключите измельчитель.

С помощью стерильных щипцов проведите диск над новой 60-миллиметровой посудой. Используйте переводную пипетку, чтобы промыть HBSS плюс глюкозу на диске, чтобы ломтики упали в чашку. Затем, прикоснувшись к образцам как можно меньше, с помощью микрозонда отделите срезы.

С помощью трансферной пипетки выделите участки мозжечка, расположенные близко к червеобразию, на отдельных вставках для клеточных культур в шестилуночном планшете и с помощью микрозонда расположите срезы в центре каждой вставки. Когда все срезы будут размещены, осторожно отсасывайте избыток HBSS плюс глюкоза и верните планшет в инкубатор для клеточных культур.

Для иммунофлюоресцентного окрашивания удалите надосадочную жидкость из каждой лунки и промойте вкладыши PBS. Зафиксируйте срезы 1 миллилитром холодного 4% параформальдегида в лунке каждой вставки, и 500 микролитрами сверху каждой вставки на 1 час.

В конце фиксации промойте вкладыши четыре раза в течение 10 минут, располагая 1 миллилитром свежего PBS под каждым вкладышем и 500 микролитрами свежего PBS поверх каждого вкладыша на орбитальном шейкере. Предварительно заполните каждую лунку 24-луночного планшета 500 микролитрами PBS-TB и с помощью кисти перенесите срезы мозжечка из каждой вставки клеточной культуры в отдельные лунки 24-луночного планшета.

Пермеабилизируйте и забейте ломтики при комнатной температуре на один час. В конце инкубации пометьте клетки 200 микролитрами первичного представляющего интерес антитела, разведенного в PBS-TB, на лунку в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия на орбитальном шейкере.

На следующее утро промойте ломтики четыре раза в течение 10 минут и нанесите 500 микролитров свежего PBS на шейкер перед маркировкой образцов соответствующими флуорофор-конъюгированными вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере, защищенном от света.

В конце инкубации запачкайте срезы 500 микролитрами соответствующего ядерного красителя на лунку в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенной от света, и с помощью пипетки для переноса закрепите срезы на предметных стеклах.

Затем дайте секциям полностью высохнуть на воздухе перед регидратацией с помощью PBS и монтажом тканей с помощью покровных стекол, покрытых примерно 80 микролитрами монтажной среды. После того, как монтажная среда отверждится, срезы мозжечка готовы к визуализации.