Диссоциация и культивирование нейронов из образцов ткани гиппокампа
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:35 мин • July 8th, 2025
Начните с образцов ткани гиппокампа, содержащих нейроны и различные ненейрональные клетки.
Добавьте раствор фермента протеазы. Фермент разрушает внеклеточный матрикс ткани, инициируя диссоциацию клеток.
Промыть плоской средой для удаления остатков ферментов.
Многократно пипетируйте переваренную ткань, чтобы механически диссоциировать клетки от ткани, образуя одноклеточную суспензию.
Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте элементы в гальванической среде.
Поместите клетки на покровное стекло, покрытое поли-D-лизином, в многолуночном планшете. Лизин усиливает прикрепление клеток.
Замените среду для покрытия средой для поддержания нейронов, содержащей необходимые питательные вещества для выживания нейронов.
Обновите половину среды поддерживающей средой, содержащей арабинозилцитозин или Ara-C.
Ara-C проникает в клетки и избирательно подавляет рост ненейрональных клеток, что приводит к их гибели.
Замените среду свежей средой для технического обслуживания, чтобы поддержать выживание нейронов.
Чтобы диссоциировать нейроны гиппокампа для культивирования, разморозьте раствор фермента протеазы, и предварительно нагрейте плоскую среду до 37 градусов Цельсия. Далее промойте рассеченный гиппокамп с помощью SLDS. Затем удалите его, и добавьте 2 миллилитра раствора фермента протеазы, и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
После этого дважды промойте экспланты гиппокампа 5-10 миллилитрами плоской среды и добавьте 5 миллилитров плоской среды. Диссоциируйте экспланты гиппокампа на отдельные клетки, создавая небольшой вихрь с помощью пипетки с пластиковым наконечником объемом 1 миллилитров. Пипетируйте вверх и вниз около 40 раз, избегая образования пузырьков кислорода, пока раствор не помутнеет и не останется крупных кусков экспланта.
Затем центрифугируйте ячейки при 1125-кратном течении силы тяжести в течение 3 минут. Удалите надосадочную жидкость вместе с клетками, погруженными в среду, и повторно суспендируйте клетки в 145 миллилитрах гальванической среды. Затем добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии на лунку в 24-луночный планшет. Инкубируйте клетки в гальванической среде при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов.
После этого удалите гальванический материал и замените его свежим средством для технического обслуживания. Через два дня замените половину среды двумя микромолярами Ara-C, растворенными в поддерживающей среде, чтобы подавить рост фибробластов, эндотелиальных и глиальных клеток. Затем, после воздействия на клетки Ara-C в течение двух дней, замените среду на свежую поддерживающую среду.
Обзор
В данной статье подробно описывается процесс диссоциации нейронов гиппокампа из образцов тканей для последующего культивирования. В ней представлены этапы подготовки клеток для их поддержания и выращивания in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Культура клеток
- Биология нейронов
Теоретическая часть
- Нейроны гиппокампа имеют решающее значение для изучения различных неврологических функций.
- Методы диссоциации клеток необходимы для отделения нейронов от ненейрональных клеток.
- Надлежащее поддержание нейрональных культур жизненно важно для точности экспериментов.
- Использование Ara-C помогает селективно подавлять рост ненейрональных клеток.
Цель исследования
- Предоставить детальную методику выделения нейронов гиппокампа.
- Углубить понимание методов культивирования нейрональных клеток.
- Повысить выживаемость и улучшить условия поддержания культивируемых нейронов.
Используемые методы
- Подготовка образцов ткани гиппокампа.
- Использование раствора протеолитических ферментов для диссоциации тканей.
- Механическая диссоциация для получения суспензии одиночных клеток.
- Применение Ara-C для ингибирования роста ненейрональных клеток.
Основные результаты
- Успешная диссоциация нейронов из ткани гиппокампа.
- Эффективное поддержание нейрональных культур в течение длительного времени.
- Продемонстрированное селективное ингибирование ненейрональных клеток с помощью Ara-C.
- Разработка надежного протокола для последующих исследований.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно выделять и культивировать нейроны гиппокампа.
- Использование Ara-C имеет решающее значение для поддержания чистоты нейронной культуры.
- Эта методология может быть применена в различных исследованиях в области нейронаук.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежная диссоциация и культивирование нейронов гиппокампа позволяют создавать стандартизированные, обогащенные нейронами системы in vitro для ранних этапов разработки лекарственных препаратов в нейробиологии. Такие культуры представляют собой контролируемую платформу для изучения нейрональных механизмов, что повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижении механистических рисков. Селективность данного метода в отношении нейрональных популяций улучшает трансляционную преемственность и процесс принятия решений по портфелю препаратов в рамках нейробиологических программ разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет изолировать чистые популяции нейронов для исследований, основанных на проверке гипотез.
- Поддерживает снижение механистических рисков за счет минимизации влияния ненейрональных конфаундеров.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней в нейрональных системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Повышает прогностическую достоверность для раннего отбора проектов в портфеле.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимость культур нейронов для стандартизации анализа.
- Позволяет проводить количественное измерение нейрональных ответов на соединения.
- Поддерживает масштабируемость и повторное использование платформы для скрининговых кампаний.
- Снижает вариабельность за счет ограничения воздействия ненейрональных клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели in vitro в соответствие с нейронной биологией, релевантной заболеванию.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе данных, специфичных для нейронов.
- Способствует поиску биомаркеров в системах, обогащенных нейронами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол диссоциации и культивирования нейронов занимает промежуточное положение между этапами первичного поиска и разработки анализа, обеспечивая создание базовых систем для последующего скрининга и изучения механизмов.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в нейрон-специфических контекстах.
- Скрининг: позволяет проводить воспроизводимые количественные нейрональные анализы для оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает измерение жизнеспособности и отклика нейронов, что позволяет проводить статистическое сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: служит связующим звеном с доклиническими моделями за счет поддержания чистоты и релевантности нейронов.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый для различных проектов в области нейробиологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую точность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях нейронов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость процессов культивирования нейронов.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок, а также повышает эффективность использования капитала за счет внедрения надежных нейрональных анализов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и развитие активов в области нейробиологии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с нейрональной тканью и методами культивирования клеток.
- Необходим доступ к растворам протеолитических ферментов, планшетам с поли-D-лизиновым покрытием и контролируемым условиям инкубации.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости в многоцентровых исследованиях.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных подтипов нейронов или видов животных.
- Эффективность анализа зависит от качественного удаления ненейрональных клеток.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в
Похожие видео
0 Просмотры
Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов
Похожие видео
0 Просмотры
Использование постнатальной электропорации in vivo для изучения морфологии нейронов мозжечковых гранул и развития синапсов
Похожие видео
0 Просмотры
Первичные культуры нейронов гиппокампа от P0 новорожденных крыс
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и культуре нейронов гиппокампа мышей от пренатального
Похожие видео
0 Просмотры
Методика культивирования нейронов гиппокампа мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Получение различных популяций нервных клеток из гиппокампа крысы
Похожие видео
0 Просмотры
Секс Стратифицированная нейронов культур для изучения ишемических: Подготовка гибель клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Упрощенный метод для сверхнизкой плотности, Долгосрочное Первичный гиппокампа Нейрон культуры
Похожие видео
0 Просмотры
Низкая плотность первичного гиппокамп Нейрон культура
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026