Получение органоидной культуры из суспензии клеток опухоли головного мозга

Начните с микроцентрифужной пробирки, содержащей богатый ламинином внеклеточный матрикс или lrECM. Ламинин является структурным компонентом, в изобилии присутствующим в головном мозге.

Держите трубку на льду, чтобы предотвратить полимеризацию IrECM.

Добавьте клетки опухоли мозга и тщательно перемешайте, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.

Далее переложите смесь на парапленочные формочки, формируя капельки.

Инкубируйте для облегчения полимеризации lrECM с образованием каркаса, имитирующего естественную среду клеток.

Теперь промойте затвердевшие органоиды в чашке Петри, содержащей питательную среду, затем инкубируйте.

Питательная среда обеспечивает организм необходимыми питательными веществами и факторами роста, поддерживая деление клеток.

Внутри органоида клетки самоорганизуются, мигрируя и вторгаясь.

После инкубации наклоните тарелку, чтобы осядли органоиды.

Осторожно удалите лишнюю среду и добавьте свежую среду.

Инкубировать с легким встряхиванием.

Это равномерно распределяет питательные вещества и усиливает рост органоидов.

Чтобы получить органоиды из одноклеточной суспензии, добавьте соответствующее количество богатого ламинином внеклеточного матрикса или lrECM в небольшую центрифужную пробирку в ведре со льдом или холодном блоке.

Приготовьте клеточную смесь, содержащую 20 000 клеток на органоид. Тщательно перемешайте смесь клеточной суспензии lrECM, чтобы избежать оседания клеток, которое может привести к неравномерному образованию органоидов. Далее аккуратно нанесите пипеткой 20 микролитров смеси на парапленочную форму, чтобы образовалась жемчужная капля. Обязательно охлаждайте наконечник пипетки каждые два-три органоида, чтобы предотвратить полимеризацию lrECM.

После того, как нужное количество органоидов будет помещено пипеткой на парапленочную форму в 10-сантиметровом планшете для культивирования, инкубируйте органоиды при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1-2 часов в инкубаторе для клеточных культур. После того, как органоиды затвердеют, аккуратно смойте органоиды с парапленочной формы средой NBMC с помощью наконечника P1000 и соберите их в новую 10-сантиметровую культуральную пластину, содержащую 20 миллилитров NBMC. Поместите тарелку с культурой в инкубатор без встряхивания на 4 дня.

Через 4 дня замените носитель в пластине. Для этого поместите лист темной бумаги под пластину для клеточной культуры. Наклоните тарелку и подождите 20 секунд. Когда органоиды полностью осядут на дне чашки, медленно извлеките среду с помощью большой стеклянной пипетки.

После добавления нового носителя поместите планшет в инкубатор на орбитальный вибростенд со скоростью 80 об/мин и после этого меняйте среду каждые 2–3 дня.