Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в олигодендроциты

Начните с посева человеческих эмбриональных стволовых клеток на многолуночный планшет с матричным покрытием.

Матричная среда предотвращает несвоевременное созревание в специализированную ячейку.

Добавьте подходящую поддерживающую среду с добавлением диметилсульфоксида или ДМСО.

Лечение ДМСО усиливает реакцию клеток на сигналы созревания.

Затем замените среду средой нейронной индукции, содержащей специфические ингибиторы.

Ингибиторы блокируют сигналы развития ненервных клеток, направляя стволовые клетки к трансформации в нейронные клетки-предшественники или NPC.

Замените среду раствором для диссоциации NPC. Переместите нужное количество клеток в другую многолуночную пластину.

Добавьте клеточную среду для дифференцировки, дополненную ДМСО, чтобы способствовать превращению NPC в клетки-предшественники олигодендроцитов или OPC.

Замените среду средой для созревания, специфичной для клеток, чтобы облегчить развитие OPC в олигодендроциты.

Для получения нейронных клеток-предшественников необходимо культивировать H1 ES клетки человека и трансдифференцировать их в нейронные клетки-предшественники, как описано в текстовой рукописи. На отрицательный день 1 засейте от 0,5 до 1 миллиона клеток в среду для поддержания ES-клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, покрытого раствором матрицы с уменьшенным фактором роста.

В нулевой день обрабатывайте клетки в течение 24 часов средой для поддержания ЭС-клеток, дополненной 2% ДМСО. С 1 по 6 дни замените полную среду на теплую среду для нейронной индукции, содержащую ингибиторы SMAD из коммерческого набора. На 7-й день пропустите NPC с помощью раствора для отрыва клеток и нанесите на них тарелки с плотностью посадки от 1 до 2 x 10⁵ клеток на лунку 24-луночного планшета.

Чтобы получить клетки-предшественники олигодендроцитов, поместите NPC в теплую среду для нейронной индукции ингибиторами SMAD из коммерческого набора. На 8-й день приготовьте раствор 1% ДМСО в среде для дифференцировки OPC и обрабатывайте осажденных NPC в течение 24 часов. На 9-й день замените среду свежей средой для дифференцировки OPC без ДМСО, затем подкармливайте клетки через день до 15-го дня.

Если клетки достигнут слияния до 15-го дня, пропустите их до плотности посева от 1 до 2 х 10 5 клеток на лунку. На 14-е сутки планшеты OPC помещают в среду для дифференцировки OPC с плотностью от 1 до 2 x 10 по⁵ клеток на лунку в 24-луночном планшете. На 15-й день замените среду для созревания ОЛ.

Меняйте носитель через день или каждый день. Когда клетки достигнут 90% слияния, разделите их в соотношении 1 к 3 на два пассажа или до тех пор, пока деление клеток существенно не замедлится. Если OPC делятся слишком быстро и достигают слияния менее чем за три дня, добавьте Ara-C в концентрации от 2 до 5 микромолей в течение одного-трех дней.