Методика создания двумерного монослоя клеток мозжечка из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Начнем с индуцированных человеком колоний плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых на адгезивной матрице базальной мембраны.

Добавьте среду для дифференцировки мозжечка, содержащую специфический гормон, фактор роста и низкомолекулярные ингибиторы.

Приподнимите колонии с помощью стеклянной пипетки и переложите их на сверхнизкую насадочную пластину.

Поверхность с низким уровнем прикрепления поддерживает клетки во взвешенном состоянии, способствуя их агрегации в трехмерные эмбриоидные тельца, или БЭ.

Гормон, фактор роста и ингибиторы связываются с соответствующими центрами-мишенями, способствуя дифференцировке стволовых клеток в предшественники нейронов.

Перенесите БЭ в лунки культуральных планшетов, покрытых синтетическим полимером и адгезионным белком для облегчения прикрепления БЭ.

Замените среду средой для дифференцировки, не содержащей ингибиторов.

Клетки начинают мигрировать наружу из БЭ, образуя 2D-монослой.

Удалите среду и добавьте среду для созревания мозжечка.

Факторы роста в этой среде индуцируют созревание предшественников нейронов в отдельные предшественники нейронов мозжечка.

В нулевой день добавьте 1 миллилитр среды для дифференцировки мозжечка с добавлением 10 микромоляров Y27632 и SB431542 в каждую лунку шестилуночной сверхнизкой насадки или планшета ULA и поместите его в инкубатор до тех пор, пока поднятые колонии не будут готовы к добавлению в лунки. Очистите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки. Отсадите среду, и добавьте 1 миллилитр раствора для пропускания iPSC на каждую 35-миллиметровую посуду.

После трех минут инкубации при температуре 37 градусов Цельсия аспирируйте среду и добавьте по 2 миллилитра среды для дифференцировки мозжечка с добавлением 10 микромоляров Y27632 и SB431542. При 4-кратном увеличении инвертированного микроскопа с проходящим светом приподнимите колонии с помощью изогнутого края стеклянной пипетки. После того, как каждая колония будет поднята, аккуратно перенесите все колонии в одну лунку 6-луночного планшета ULA с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров. Повторите этот процесс для каждой планшета iPSC и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.

На 2-й день добавьте FGF2 в каждую лунку, чтобы довести конечную концентрацию до 50 нанограммов на миллилитр. На 7-й день замените одну треть среды, отасунув 1 миллилитр отработанной среды, и замените ее 1 миллилитром свежей среды для дифференцировки мозжечка. Инкубируйте эмбриоидные тела в течение семи дней.

На 14-й день поверните пластину, чтобы собрать все эмбриоидные тела в центре пластины. Затем, наклоните пластину, и отсасывайте всю отработанную среду с помощью пипетки объемом 1000 микролитров от края. По мере уменьшения количества медиума медленно положите пластину на плоскую поверхность и продолжайте аспирацию, оставляя достаточно среды, чтобы избежать высыхания эмбриоидных тел.

Далее добавьте 3 миллилитра свежей среды для дифференцировки мозжечка, дополненной 10 микромолярами. У27632. Затем перенесите эмбриоидные тельца с помощью 10-миллилитровой серологической пипетки в чашку, покрытую поли-L-орнитином ламинином. На 15-й день аспирируйте среду и замените ее свежей средой для дифференцировки мозжечка.