Культивирование и поддержание дофаминергических нейронов из эмбриональной ткани мозга мыши

Обработайте эмбриональную ткань среднего мозга, богатую развивающимися дофаминергическими нейронами, раствором трипсина-ЭДТА, чтобы отделить их от тканевого матрикса.

Добавьте деактивирующую среду для подавления активности ферментов, а затем промойте для удаления остатков ферментов.

Многократно пипетируйте салфетку. Эмбриональные нейроны обладают меньшим количеством проекций, снижая стресс во время этого нарушения и генерируя суспензию одиночных клеток.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте нейроны в полной среде. Перенесите эти нейроны на покровное стекло с полимерным покрытием для прикрепления клеток.

Поместите покровное стекло в многолуночную пластину с полной средой, обеспечивающей питательными веществами и факторами роста, необходимыми для роста нейронов.

Антибиотики в этой среде предотвращают рост бактерий, поддерживая жизнеспособность нейронов.

По мере роста и созревания нейронов у них развиваются клеточные проекции, такие как аксоны и дендриты, образуя синаптические связи.

Периодически удаляйте половину использованных сред для устранения токсичных побочных продуктов.

Добавьте свежую среду для длительного поддержания дофаминергических нейронов.

Под капюшон извлеките HBSS из коллекции вентрального среднего мозга. Затем добавьте миллилитр теплого 0,05% трипсина-ЭДТА, достаточно раствора на 12 кусочков ткани. Инкубируйте ткань при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5-10 минут. Под капотом замените трипсин-ЭДТА на 1 миллилитр дезактивирующего средства.

Аккуратно перемешайте смесь, а затем удалите деактивирующую среду, но оставьте достаточно среды, чтобы диссоциированные клетки не были выброшены. Далее промойте ткани полным средством два раза, не теряя клеток. Теперь добавьте 1 миллилитр готовой среды. Затем растирайте ткань с помощью отполированной пипеткой, не образуя пузырьков, до получения одноклеточной суспензии. Примерно от 8 до 10 проходов должно быть достаточно.

После растирания центрифугируйте ячейки по 400 г в течение 5 минут. Удалите среду, и повторно суспендируйте клетки в 1 миллилитре готовой среды. Пипеткой процеживайте клетки до 4 раз, чтобы добиться получения суспензии. Начните с подсчета и оценки здоровья клеток в суспензии с помощью исключения трипанового синего с помощью гемоцитометра.

Теперь отрегулируйте клеточную суспензию до 1500 клеток на микролитр. Затем перенесите стерилизованные крышки микроцентрифужных пробирок в 100-миллиметровую посуду. Наденьте подготовленные покровные степки на колпачки с помощью щипцов. Не стирайте покровные стекла и старайтесь не допускать их пересыхания. Загрузите по 100 микролитров суспензии на каждый покровный лист.

Этот несколько необычный метод обеспечивает 90% жизнеспособность культуры и является важным шагом к успеху. Затем, закройте чашку Петри, и перенесите ее в инкубатор на час. После инкубации осторожно переложите покровные стекла со средой в 24-луночные планшеты, содержащие 400 микролитров полной среды, подогретой до 37 градусов Цельсия в каждую лунку. Затем инкубируйте клетки на ночь.

Первые несколько часов являются наиболее важными для выживания клеток. В течение 24 часов аккуратно добавьте по полмиллилитра готовой среды в каждую лунку. Каждые 2 недели меняйте половину носителя. Если культура пожелтела, то смену полусреды можно провести раньше, но смена все равно должна быть нечастой. В этих условиях дофаминергические нейроны будут выживать более 6 недель.