Выделение и культивирование клеток из диффузной внутренней понтинной глиомы

Начните с фрагментов ткани ствола мозга, содержащих диффузную внутреннюю понтинную глиому – опухоль, полученную из глиальных клеток-предшественников в миелинизированной среде, богатой нервами.

Лечение протеолитическими ферментами для разрушения внеклеточного матрикса ткани.

После инкубации повторно пипетируйте содержимое, чтобы облегчить диссоциацию клеток и деградацию миелиновой оболочки.

Фильтр и центрифуга для сбора ячеек. Извлеките надосадочную жидкость и снова суспендируйте их в холодном буфере.

Добавьте раствор сахарозы для разделения градиента плотности и тщательно перемешайте.

Затем центрифугируйте для отделения более тяжелых клеток от более легких остатков миелина.

Удалите слой миелина и добавьте буфер для лизиса эритроцитов.

Добавьте холодный буфер, чтобы остановить действие лизиса. Центрифугуйте и удалите надосадочную жидкость, чтобы удалить лизированные эритроциты.

Ресуспендируйте клетки в теплой нейробазальной среде и культивируйте их в колбе без покрытия.

Отсутствие нейротропных факторов вызывает гибель нейронов, в то время как глиальные клетки-предшественники используют питательные вещества и факторы роста, что приводит к пролиферации. Добавляйте свежую среду для поддержания уровня фактора роста.

Со временем эти клетки спонтанно агрегируются в клеточные кластеры, образуя свободно плавающие нейросферы.

При этой процедуре коническая трубка, содержащая оставшиеся фрагменты ткани, центрифугируется в течение пяти минут. После этого удалите надосадочную жидкость и добавьте предварительно подогретый ферментативный раствор для пищеварения с таким расчетом, чтобы на каждый 1 миллилитр ткани приходилось 5 миллилитров раствора для пищеварения. Затем запечатайте коническую крышку пробирки лабораторной пленкой и инкубируйте реакцию на ротаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

После инкубации тщательно измельчите образцы. Используя серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, пипетируйте образец вверх и вниз от 6 до 8 раз, избегая образования чрезмерных пузырьков воздуха. Затем добавьте наконечник для пипетки объемом 1000 микролитров в конец пипетки и растирайте образец еще от 6 до 8 раз.

Дайте оставшимся кусочкам осесть на дно пробирки. Затем извлеките и отфильтруйте надосадочную жидкость с еще подвешенной клеткой через 100-микронный фильтр в новую 50-миллилитровую коническую трубку с маркировкой ферментативной диссоциации и храните ее на льду. После этого центрифугируйте пробирку ферментативной диссоциации в течение пяти минут и продолжайте центрифугирование градиентом сахарозы. Если образец все еще находится во взвешенном состоянии в растворе, центрифугируйте его в течение пяти минут.

Далее удалите надосадочную жидкость, и ресуспендируйте ткани в 20 миллилитрах холодного HBSS без кальция и магния. Затем, доведите объем до 25 миллилитров с помощью холодного HBSS. Медленно добавьте 25 миллилитров 1,8 молярного раствора сахарозы и переверните трубку для перемешивания. Это приводит к градиенту сахарозы 0,9 моляра.

Затем центрифугируйте образец без перерыва в течение 10 минут. Тщательно отсасывайте остатки миелина и как можно больше раствора сахарозы. Затем промойте образец, добавив 30 миллилитров холодного HBSS без кальция и магния, и аккуратно перемешайте. После этого центрифугируйте его в течение пяти минут.

При этой процедуре удалите надосадочную жидкость для стирки. Добавьте 5 миллилитров буфера для лизиса ACK и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу, вращая пробирку в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем угасите лизис, добавив 30 миллилитров холодного HBSS без кальция и магния.

Впоследствии центрифугируйте его в течение пяти минут. Ресуспендируйте конечную клеточную гранулу в 10-15 миллилитрах теплого полного TSM с факторами роста и количественно оцените плотность жизнеспособных клеток на гемоцитометре с использованием исключения трипанового синего. После этого перенесите окончательную клеточную суспензию в новую колбу для культур T75. Добавляйте дополнительные факторы роста через день для поддержания общего уровня фактора роста и мониторинга развития нейросфер опухолевых клеток.