Выделение и культивирование предшественников зернистых нейронов мозжечка у мышей

Возьмем, к примеру, детеныша мыши Церебеллу.

Гомогенизируйте их на более мелкие фрагменты.

Добавьте протеолитический фермент для переваривания внеклеточного матрикса ткани, разрыхляя зернистые предшественники мозжечка, или CGNP, и астроциты.

Добавьте питательную среду CGNP, содержащую сыворотку, чтобы остановить ферментативную активность. Центрифугируйте и выбросьте богатую ферментами надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте фрагменты ткани в средах CGNP. Механически диссоциируйте ткань, чтобы освободить клетки.

Как только мусор осядет, перенесите надосадочную жидкость, содержащую клетки, в новую пробирку.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость с мусором.

Ресуспендируйте клетки в среде CGNP и затравите их в лунки с несколькими лунками, покрытыми поли-D-лизином. Инкубировать.

Астроциты оседают и прочно прилипают к поли-D-лизиновому покрытию по сравнению с CGNP.

Встряхните планшет и соберите надосадочную жидкость, содержащую ГНП. Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте CGNP в среде CGNP и затравите их на многолуночный планшет с поли-L-орнитиновым покрытием. Инкубировать.

CGNP прикрепляются к покрытой поверхности и размножаются с помощью компонентов среды и поли-L-орнитина.

Переложите три-пять мозжечков в 15-миллилитровые пробирки. Промойте мозжечок глюкозой HBSS перед центрифугированием. Центрифугируйте пробирки для сбора ткани. После окончательного промывания гомогенизируйте мозжечок, аккуратно пипетируя вверх и вниз два-три раза пипеткой объемом 1 миллилитров, пока размер фрагментов не составит от 0,5 до 1 кубического миллиметра.

Аккуратно удалите всю жидкость, пока не останется 2,5 миллилитров. Затем добавьте 0,05% трипсина в пробирку с глюкозой HBSS, содержащей церебеллу, и инкубируйте ткань на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Переворачивайте ткань каждые 1-3 минуты. После инкубации остановите пищеварение, добавив 5 миллилитров среды для культивирования клеток cGMP или CGM, и соберите ткань центрифугированием, как и раньше.

После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 миллилитр НМГ. Растирайте ткань кончиком пипетки объемом 1 миллилитров, не допуская образования пузырьков воздуха. Затем добавьте 5 миллилитров НМГ и выдержите смесь в течение двух минут на льду, чтобы осядли остатки тканей. Как только ткань осядет, переложите надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую трубку. Затем добавьте 2 миллилитра CGM к остаточной ткани и повторите процедуру растирания перед сбором надосадочной жидкости и выбросом остатков ткани.

Соберите надосадочную жидкость из каждой 15-миллилитровой пробирки ткани и центрифугируйте для сбора клеток мозжечка. Повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах НМГ. Поскольку астроциты прилипают к поли-D-лизину быстрее и сильнее, чем цГМФ, добавьте до 4 миллилитров клеточной суспензии в лунки 6-луночных планшетов, покрытых поли-D-лизином, и инкубируйте в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия для удаления астроцитов.

Встряхните тарелку. Соберите надосадочную жидкость в 15-миллилитровую пробирку, а затем центрифугируйте надосадочную жидкость, как и раньше. Повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах НМГ и подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Нейбауэра. Через 4-6 часов прилипшие цГМФ выглядят круглыми и являются пролиферирующими. Засейте клетки в CGM на пластинах, покрытых поли-L-орнитином, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия, 5%_CO2 и 100% относительной влажности.