Получение сфероидов из плюрипотентных стволовых клеток человека

Начните с колоний человеческих плюрипотентных стволовых клеток или hPSCs, прикрепленных к подходящему субстрату в культуральной среде.

Удалите среду. Добавьте нейронную среду, содержащую специфические ингибиторы, и инкубируйте.

Эти ингибиторы направляют созревание hPSCs в направлении нейронной линии, образуя нейроэктодермальные колонии. Они являются предшественниками небольших сферических структур, называемых сфероидами.

Удалите среду и промойте солевым буфером.

Инкубируйте с пищеварительным ферментом, чтобы отделить колонии от тарелки.

Добавьте нейронную среду, чтобы остановить ферментативную активность.

Соберите колонии и переложите их в трубку.

Дайте им осесть, а затем выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте колонии в нейронной среде, содержащей фактор роста.

Пересадите колонии в многолуночный планшет и инкубируйте.

Этот фактор роста способствует самоорганизации и размножению нейроэктодермальных клеток, приводя их к образованию сфероида.

Для начала поместите колонии hPSC на матрицу базальной мембраны, квалифицированную hESC, из одной лунки 6-луночного планшета при 60% слиянии в три лунки для достижения плотности от 20% до 30%, а затем приступайте к индукции 2D-нейроэктодермальных колоний.

Добавляйте свежие среды N2 с двойными ингибиторами SMAD ежедневно в каждую лунку в течение следующих 3 дней. Для получения 3D нейроэктодермальных сфероидов из индуцированных 2D нейроэктодермальных колоний удалите 2 миллилитра среды N2 из 6-луночного планшета и промойте один раз HBSS, чтобы убедиться, что вся среда N2 удалена.

Добавьте по 1 миллилитру диспа в каждую колоносодержащую лунку. Инкубируйте планшет в течение 20-25 минут при температуре 37 градусов Цельсия и регулярно проверяйте наличие отделения колонии. По окончании инкубации, чтобы остановить активность фермента dispase, добавьте в лунку 1 миллилитр среды N2. Используя наконечник для пипетки P1000 с широким отверстием или модифицированную чашку наконечника для пипетки P1000 со стерильными ножницами, перенесите колонии в 15-миллилитровую пробирку и позвольте колониям опуститься на дно пробирки под действием силы тяжести.

Затем с помощью стандартного наконечника для дозатора P1000 осторожно удалите надосадочную жидкость. Замените его 1 миллилитром свежей среды N2 и повторите промывку трижды, чтобы обеспечить полное удаление отходов. После ресуспендирования клеточных сгустков и среды N2 перенесите клеточную суспензию в одну лунку 6-луночного планшета и добавьте 40 нанограмм на миллилитр bFGF.