Получение сфероидов из плюрипотентных стволовых клеток человека

Начните с колоний человеческих плюрипотентных стволовых клеток или hPSCs, прикрепленных к подходящему субстрату в культуральной среде.

Удалите среду. Добавьте нейронную среду, содержащую специфические ингибиторы, и инкубируйте.

Эти ингибиторы направляют созревание hPSCs в направлении нейронной линии, образуя нейроэктодермальные колонии. Они являются предшественниками небольших сферических структур, называемых сфероидами.

Удалите среду и промойте солевым буфером.

Инкубируйте с пищеварительным ферментом, чтобы отделить колонии от тарелки.

Добавьте нейронную среду, чтобы остановить ферментативную активность.

Соберите колонии и переложите их в трубку.

Дайте им осесть, а затем выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте колонии в нейронной среде, содержащей фактор роста.

Пересадите колонии в многолуночный планшет и инкубируйте.

Этот фактор роста способствует самоорганизации и размножению нейроэктодермальных клеток, приводя их к образованию сфероида.

Для начала поместите колонии hPSC на матрицу базальной мембраны, квалифицированную hESC, из одной лунки 6-луночного планшета при 60% слиянии в три лунки для достижения плотности от 20% до 30%, а затем приступайте к индукции 2D-нейроэкто