JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 2:57 мин • July 8th, 2025
Возьмем, к примеру, микрофлюидное устройство, покрытое синтетическим полимером и белком адгезии.
Устройство состоит из лунок и соединенных между собой камер для культивирования, разделенных микроканавками.
Камеры содержат перфорированные отверстия для размещения тканей.
Получите ганглии тройничного нерва, совокупность клеточных тельец нейронов тройничного нерва, и зубные зачатки, пренатальные структуры, которые развиваются во взрослые зубы, из эмбриона мыши.
Поместите салфетки в отверстия и добавьте соответствующую питательную среду.
Питательные вещества и витамины в зародышевой среде зубов способствуют выживанию зародышевых зубов во время культивирования.
Покрытая поверхность устройства и факторы роста в средах тройничных ганглиев способствуют росту нейритов и аксонов.
Аксоны достигают зародышевой камеры зуба через микробороздки.
Сигналы, поступающие от зубов, приводят к отталкиванию нейронов, позволяя аксонам окружать зачаток зуба, не иннервируя его.
Промойте камеры культуры буфером и зафиксируйте ткани фиксатором.
Теперь сокультура готова к дальнейшему анализу.
После вскрытия ганглиев тройничного нерва и зачатков зуба удалите ламинин из микрофлюидных устройств и заполните камеры 200 микролитрами соответствующей среды. С помощью щипцов аккуратно перенесите рассеченные ганглии тройничного нерва и зачатки зубов в отверстия, созданные с помощью биопсийного перфоратора. Следите за тем, чтобы зубные зачатки не плавали и тонули до тех пор, пока не соприкоснутся с покровными стеклами.
Культивируйте образцы в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Меняйте питательную среду каждые 48 часов в течение 10 дней. Чтобы сменить среду, сначала удалите ее, направив пипетку к внешней стороне лунок. Затем добавьте свежую предварительно прогретую среду со стороны лунок, расположенных напротив камер.
В течение периода культивирования визуализируйте сокультуры в любое время с помощью световой микроскопии. После периода культивирования промойте камеры, пипетируя 150 микролитров PBS в одну лунку на камеру и пропуская PBS через камеры. Повторите стирку в общей сложности три раза.
После последней промывки удалите PBS и закрепите образцы, пипетируя 150 микролитров 4% параформальдегида в PBS в одну лунку на камеру и позволяя ему течь в другую камеру. Инкубируйте устройство при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем дважды промойте камеры PBS и приступайте к дальнейшему анализу, такому как иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация выроста.