Методика выделения сателлитных клеток из мышечной ткани головы крысы

Начните с мышцы крысиной головы и разрубите ее на фрагменты.

Добавьте коктейль из протеолитических ферментов и инкубируйте, слегка встряхивая.

Ферменты переваривают внеклеточный матрикс ткани, расслабляя мышечные волокна.

Добавьте среду, содержащую сывороточные белки, для инактивации ферментов.

Перенесите ткань в пробирку, центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендия ткани в среде. Повторите механическое разрушение и центрифугирование дважды, чтобы получить однородную суспензию сателлитных клеток — стволовых клеток, имеющих решающее значение для восстановления и регенерации мышц.

Соберите сокровенную клетку, содержащую надосадочную жидкость.

Пропустите через клеточное ситечко, чтобы получить одноклеточную суспензию. Центрифугируйте, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в средах.

Капли клеточной суспензии поместите на лунки камеры с белковым покрытием из внеклеточного матрикса.

Поверхность с покрытием облегчает прикрепление сателлитной ячейки. Добавьте в лунки фильтрующий материал.

Факторы роста в среде индуцируют пролиферацию сателлитных клеток и дифференцировку в миобласты — предшественники мышечных клеток, которые в дальнейшем пролиферируют и сливаются, образуя многоядерные миотрубки.

Миотрубки в конечном итоге созревают в мышечные волокна.

Чтобы изолировать клетки-сателлиты, перенесите каждую мышцу в отдельные лунки шестилуночной пластины и разрежьте ткани на маленькие кусочки по 2 миллиметра, стараясь не слишком измельчать мышцы. Далее тщательно инкубируйте фрагменты тканей в 2,5 миллилитрах 0,1% раствора проназы на лунку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут, с легким встряхиванием, каждые 20 минут.

Когда пучки волокон проявят разрыхленный вид, добавьте в каждую лунку по 2,5 миллилитра DMEM, дополненного лошадиной сывороткой и антибиотиками, и переложите переваренные ткани в отдельные 15-миллилитровые конические трубки. Уменьшите тканевые кашицы и сцедите надосадочную жидкость. Затем добавьте по 5 миллилитров среды в каждую пробирку и гомогенизируйте ткань с помощью 10-миллилитровой пластиковой пипетки.

Снова раскрутите ткани вниз и перенесите надосадочную жидкость в новые 15-миллилитровые конические пробирки. Затем добавьте в пробирки еще 5 миллилитров среды, и снова растирайте кусочки ткани до тех пор, пока фрагменты не пройдут через пипетку.

После очередного центрифугирования соберите надосадочную жидкость в соответствующие пробирки и отфильтруйте клеточные суспензии через 40-микронные сетчатые фильтры в отдельные 50-миллилитровые пробирки. Промойте ситечки 1 миллилитром DMEM для максимального восстановления клеток. Затем раскрутите ячейки вниз. Повторно суспендируйте гранулы в свежей среде и подсчитайте клетки.

Для культивирования выделенных клеток-сателлитов далее разбавляют клеточные суспензии до 1,5 х 10³ клеток на 10 мкл питательной среды. Затем добавьте 10 микролитров клеток на каждое заранее подготовленное гелевое пятно внеклеточного матрикса и инкубируйте гели при температуре 37 градусов Цельсия. Через шесть часов осторожно добавьте по 400 микролитров питательной среды в каждое гелевое пятно, и верните предметные стекла в инкубатор. Через трое суток инициируют дифференцировку клеток с добавлением соответствующей питательной среды.