Нейрогенез, индуцированный ретиноевой кислотой, с использованием клеток эмбриональной карциномы мыши

Возьмем суспензию клеток эмбриональной карциномы мыши, способную дифференцироваться в различные типы клеток.

Затравочные клетки на гидрофобной чашке для культивирования, содержащей среду и ретиноевую кислоту.

инкубировать. Гидрофобные поверхности предотвращают адгезию клеток, заставляя клетки образовывать агрегаты.

Ретиноевая кислота проникает в клеточные агрегаты, запуская сигнальные пути и вызывая дифференцировку в нейронные клетки-предшественники.

После инкубации соберите клеточные агрегаты.

Выбросьте носители.

Добавьте среды, содержащие ретиноевую кислоту, и высадите заполнители на гидрофобную чашку для культуры.

инкубировать. Ретиноевая кислота способствует устойчивой клеточной дифференцировке в нейроны.

Соберите агрегаты и удалите носители.

Добавьте протеолитический фермент, чтобы разрушить межклеточные спайки внутри агрегатов.

Добавьте среду, содержащую сыворотку, чтобы остановить ферментативную активность.

Механически диссоциируют агрегаты, образуя нейронную взвесь.

Центрифугируйте и выбросьте богатую ферментами надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте нейроны в среде и засейте их на адгезивную многолуночную пластину, содержащую среду.

инкубировать. Нейроны прилипают к пластинке и созревают, расширяя длинные выступы.

Для получения агрегатов начните с добавления 10 миллилитров дифференцировочной среды с добавлением 5 микролитров RA в 100-миллилитровую чашку для необработанных культур. Посадите 1 миллион клеток в чашку для культивирования и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух дней, чтобы стимулировать образование агрегатов.

После инкубации с помощью 10-миллилитровой пипетки отсадите среду, содержащую агрегаты, и переложите ее в 15-миллилитровую пробирку комнатной температуры. Подождите 1,5 минуты, чтобы агрегаты осядли на дне, а затем, выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте 10 миллилитров свежей дифференцировочной среды с добавлением 0,5 микромолярного РА. Аккуратно высадите агрегаты в новую 100-миллиметровую необработанную чашку для культивирования и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух дней.

Для начала используйте 10-миллилитровую пипетку, чтобы перенести клеточные агрегаты в 15-миллилитровую пробирку. Подождите 1,5 минуты при комнатной температуре, чтобы агрегаты осядли на дне, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Промойте агрегаты сывороткой и DMEM, не содержащими антибиотиков. Подождите, пока агрегаты ячеек осядут на дно. Выбросьте надосадочную жидкость, и добавьте 2 миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА.

Инкубируйте трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, постукивая каждые две минуты, чтобы клетки оставались во взвешенном состоянии. Затем добавьте 4 миллилитра поддерживающей среды, чтобы остановить активность трипсина, и пипетируйте вверх и вниз 20 раз с помощью пипетки объемом 1 миллилитров.

Наконец, центрифугируйте клетки при 200-кратном перегрузке и комнатной температуре в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 миллилитрах поддерживающей среды. Используйте счетчик ячеек, чтобы определить номер ячейки, и приступайте к нанесению покрытий на ячейки. К пластинчатым клеткам сначала добавляют 3 миллилитра на лунку поддерживающей среды в шестилуночный культуральный планшет. Затем засейте клетки с плотностью 500 000 на лунку. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.