Дифференцировка эмбриоидных клеток организма в нейральные предшественники с помощью ретиноевой кислоты

Начните с эмбриональных стволовых клеток, культивируемых на слое фидерных клеток фибробластов, которые поддерживают стволовые клетки в их недифференцированном состоянии.

Добавьте ферменты трипсина и ЭДТА, чтобы нарушить межклеточную адгезию и отделить клетки.

Позже добавьте обогащенную сывороткой культуральную среду, чтобы остановить активность фермента, и перенесите клеточную суспензию в пробирку.

Центрифугой собирают клетки, удаляют надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируют клетки в среде, содержащей ретиноевую кислоту.

Поместите капли этой клеточной суспензии на основание неадгезивной чашки для культивирования.

Переверните основание, чтобы образовались висячие капли, и расположите его над крышкой чашки для культуры, заполненной буфером, чтобы капли не высохли.

В висячих каплях гравитация заставляет клетки оседать на дне, в конечном итоге объединяясь в трехмерные структуры, называемые эмбриоидными телами.

Далее клетки поглощают ретиноевую кислоту, которая модулирует различные внутриклеточные сигнальные пути.

Эта модуляция стимулирует дифференцировку стволовых клеток в нейральные клетки-предшественники, обладающие способностью к продуцированию нейронов.

Начните формирование эмбриоидного тела путем забора эмбриональных стволовых клеток с 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 2-5 минут при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа. Добавьте свежую среду Iscove's Modified Dulbecco's или IMDM с 15% FBS в отделяющиеся клетки, затем перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.

Центрифугируйте при 160 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и приготовьте суспензию 5 x 10⁵ клеток на миллилитр в IMDM с 0,5 микромолярной ретиноевой кислотой. Затем с помощью 8-канальной пипетки и наконечников по 200 микролитров нанесите 120 микролитров капель на 100-миллилитровую чашку Петри. Переверните посуду и заполните перевернутую крышку PBS, чтобы предотвратить высыхание висячих капель. Культивируйте при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа в течение 3-4 дней.