Анализ миелинизации, индуцированной экстракордукцией in vitro для клеток-предшественников олигодендроцитов

Возьмите адгезивные культуры первичных клеток-предшественников олигодендроцитов, или OPCs, в питательной среде.

Добавьте в контрольную лунку контрольные лентивирусные векторы и тестовые векторы, кодирующие сигнальные белки, регулирующие миелинизацию, в тестовую лунку, затем инкубируйте.

Клетки интернализуют векторы, а вирусная РНК обратно транскрибируется в ДНК и встраивается в геном хозяина, экспрессируя сигнальные белки в тестовых клетках.

Введите ферменты, чтобы отделить OPC от субстрата.

Нейтрализуйте ферменты и центрифугируйте для удаления ферментов.

Добавьте питательную среду и перенесите OPC на покровные стекла внутри микропланшета с прикрепленным ганглием дорсального корешка или нейронами DRG. Дайте OPC устояться.

Заполните лунки питательной средой и инкубируйте. Взаимодействие с нейронами DRG запускает созревание OPC в олигодендроциты.

Экспрессируемые сигнальные белки индуцируют олигодендроциты к образованию миелиновых оболочек вокруг нейронов DRG.

Оцените индуцированное сигнальным белком образование миелиновой оболочки в тестовых клетках по сравнению с клетками, трансдуцированными с помощью контрольного вектора.

Для этого протокола имеют первичные клетки-предшественники олигодендроцитов, OPC, культивируемые в 10-сантиметровых планшетах с 10 миллилитровыми средами SATO, содержащими следующие факторы роста — CNTF, PDGF, NT3 и Forskolin. Клетки должны культивироваться в течение 24 часов в условиях 8% углекислого газа.

Начните с аспирации среды и удалите ее полностью. Затем замените его на 10 миллилитров той же среды с факторами роста. Заражайте свои OPC лентивирусом, экспрессируя интересующий вас белок, добавляя необходимое количество вируса по каплям в среду.

Кроме того, в отдельном планшете OPC смешайте контрольный лентивирус, который экспрессирует только GFP, в среду. Культивируйте клетки в течение еще 48 часов, затем соберите OPC из планшетов для посева на культивируемые нейроны DRG.

Сначала промойте каждую пластину 8 миллилитрами EBSS дважды. Составьте 1 миллилитр трипсина-ЭДТА 0,05% с 9 миллилитрами теплого ЭБСС. Добавьте по 5 миллилитров разведенного трипсина в каждую тарелку. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут. Нейтрализуйте трипсин, добавив 5 миллилитров 30% FBS в EBSS.

Затем с помощью пипетки объемом 10 миллилитров смойте ОПЦ с поверхности пластины. Каждый раз поворачивайте тарелку на четверть-оборот, чтобы собрать все ячейки. Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут при 180 г.

Теперь аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в миллилитрах теплой среды SATO без факторов роста и подсчитайте клетки. Затем подготавливают нейроны DRG, которые культивируются на 22-миллиметровых покровных стеклах, путем полной аспирации среды из их пластины.

Затем аккуратно посейте 200 000 OPC, по каплям, в каждую покровную пластину. Объем посева должен быть менее 200 микролитров на один покровный лист. Дайте ячейкам осесть, не двигая пластину. Через 10 минут полейте каждую лунку миллилитром теплой среды SATO. Теперь замените оставшиеся сестринские OPC средой SATO, содержащей факторы роста. Они могут быть использованы позже для проверки экспрессии интересующего белка.