Выделение нейронов вестибулярного ганглия из внутреннего уха мыши

Возьмите половину головы мышиного щенка и удалите мозг.

Разрежьте верхнюю часть черепа и иссеките окружающие ткани, чтобы визуализировать глазную капсулу, костный внешний слой, защищающий структуры внутреннего уха.

Перенесите ткань на культуральную пластину, содержащую буферную среду.

Отделите верхние и нижние вестибулярные ганглии, в которых находятся тела вестибулярных нервных клеток.

Сбрейте костный гребень и соберите лежащий под ним верхний ганглий.

Переложите верхний ганглий в свежую тарелку, содержащую буферизованную среду.

Удалите прилипшие ткани с поверхности, чтобы очистить изолированный ганглий.

Поместите ганглий в раствор, содержащий протеолитические ферменты.

Ферменты разрушают внеклеточный матрикс ткани, разрыхляя клетки.

Перенесите ганглий в чашку со стеклянным дном с полимерным покрытием, содержащую питательную среду, и механически диссоциируйте ткань, чтобы освободить клетки.

Инкубируйте, позволяя клеткам прилипнуть и создать культуру нейронов вестибулярного ганглия.

Вычерпайте мозг усыпленной мыши с помощью закрытых хирургических ножниц. Отрежьте и удалите черепной нерв, чтобы полностью отделить мозг от черепа. Начиная с затылка, снимите прозрачный пленчатый материал с помощью щипцов, а затем вырежьте верхнюю часть черепа хирургическими ножницами.

Удалите излишки ткани с затылка и шеи, чтобы сделать зону рассечения и глазную капсулу более чистой и легкодоступной. Переложите ткань во вторую чашку Петри со свежим раствором L-15. Затем найдите глазную капсулу и слуховой, верхний вестибулярный и нижний вестибулярные нервы. Отделите верхнюю и нижнюю ганглии с помощью маленьких пружинных ножниц, а слуховой нерв отрежьте его.

С помощью скальпеля аккуратно сбрейте костный гребень, чтобы ослабить костную область, под которой нерв погружается в костную капсулу. Аккуратно удалите мусор скальпелем, обнажив всю набухшую часть ганглия.

Используйте тонкие пружинные ножницы, чтобы разрезать и отделить ганглий от ветви периферического нерва, которая ныряет к утрикулу. Удалите верхний ганглий с помощью тонких щипцов и перенесите его в 35-миллиметровую чашку Петри со свежим раствором L-15.

Предварительно нагрев ферментного раствора, перелейте ферментную смесь в 35-миллиметровую чашку Петри, и поместите ее в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 10 – 15 минут. Очистите ганглий с помощью тонких щипцов и маленьких пружинных ножниц, удалив кость, лишнюю ткань, нервные волокна и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани.

Переложите очищенные ганглии в подогретый ферментный раствор и поместите обратно в инкубатор на 10-40 минут. Затем перенесите ганглии в 35-миллиметровую чашку Петри со свежим раствором L-15.

Через две-три минуты перенесите ганглии в другую 35-миллиметровую чашку Петри, заполненную отфильтрованной питательной средой. Перелейте примерно 150 микролитров отфильтрованной питательной среды на чашку со стеклянным дном с покрытием. Затем перенесите нужное количество ганглиев на покровную крышку.

Наберите небольшое количество питательной среды из чашки для культивирования и промойте пипетку для растирания средой, чтобы предотвратить прилипание ткани к стенкам стеклянной пипетки. Растирайте, осторожно и многократно пропуская ткань через пипетку до тех пор, пока ганглии не будут достаточно диссоциированы.

Через пять минут проверьте под световым микроскопом, не осели ли клетки на покровном листе. Осторожно поместите чашку для культуры в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 12-24 часа.