Выделение и культивирование глазодвигательных, трохлеарных и спинномозговых двигательных нейронов из эмбриона мыши

Возьмите трансгенную беременную мышь и хирургическим путем удалите матку с эмбрионами, содержащими флуоресцентно меченые моторные нейроны.

Перенесите матку в чашку с ледяным буфером под флуоресцентным микроскопом.

Используйте видимый свет, чтобы изолировать эмбрионы.

Удалите морду и хвост эмбрионов и расположите их в положении лежа.

Используя сигнал флуоресценции, сделайте разрез в среднем мозге, чтобы обнажить глазодвигательное и трохлеарное ядра, которые содержат моторные нейроны.

Изолируйте средний мозг, содержащий ядра.

Откройте заднюю сторону заднего мозга и спинного мозга. Изолируйте спинной мозг, иссеките оба конца и соберите колонки, содержащие спинномозговые двигательные нейроны.

Обработайте собранные ткани ферментами для диссоциации тканевого матрикса. Соберите отдельные клетки и выделите флуоресцентно помеченные нейроны с помощью FACS.

Добавьте культуральную среду к изолированным нейронам, перенесите клетки на микропланшет, покрытый культуральным субстратом, и инкубируйте, позволяя клеткам прилипать и расти.

Поддерживайте двигательные нейроны в культуре.

Начните с забора EGF-положительных эмбрионов Islet-1 у беременной мыши примерно через 11,5 дней после оплодотворения. Тщательно опрыскайте брюшную полость этанолом, а матку удалите стерильными микродиссекционными ножницами и щипцами для большого пальца. Кратковременно промойте матку в стерильном ПБС. Затем перенесите его в диссекционную пластину, наполненную предварительно охлажденным стерильным PBS.

Под ярким светом микроскопа осторожно извлеките эмбрионы из матки с помощью ножниц для микродиссекции, щипцов для перевязки большого пальца и пинцета Dumont Number 5. Затем с помощью стерильной мини-перфорированной ложки Moria перенесите каждый эмбрион в отдельную лунку 24-луночного планшета, заполненную предварительно охлажденной средой Hibernate E с низкой флуоресценцией с добавлением 1X V27.

Держа пластину на льду, перенесите один эмбрион в стерильную пластину для вскрытия и полностью накройте ее ледяным стерильным раствором сбалансированной соли Хэнка или HBSS. Используйте пинцет, чтобы удалить лицо эмбриона и хвост, не повреждая средний мозг. Затем поместите эмбрион в положение лежа с расставленными конечностями и хвостом, направленным к передней части микроскопа.

С помощью пинцета разрежьте крышу четвертого желудочка, чтобы создать небольшое отверстие. Используйте это отверстие, чтобы зацепить пинцетом пространство, образовавшееся между четвертым желудочком и его крышей. Рассекают вдоль дорсальной поверхности эмбриона рострально к коре головного мозга и латерально к нижней пластине и моторному столбу.

Затем откройте рассеченную ткань в открытом режиме, чтобы выявить GFP-положительные ядра CN3 и CN4. Осторожно отделите вентральный средний мозг от эмбриона и удалите менингеальную ткань с помощью пинцета и ножа для микродиссекции.

Препарируйте двусторонние GFP-положительные ядра CN3 и CN4 вдали от напольной пластины и других GFP-положительных окружающих тканей, стараясь не касаться или не повреждать нейроны. При сборе отдельных ядер CN3 и CN4 разрежьте вдоль среднего мозга эти два ядра и используйте пипетку P1000 для сбора рассеченной вентральной ткани среднего мозга с минимальным содержанием HBSS.

Поместите его в промаркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитров, заполненную средой для препарирования. Храните тюбик на льду до диссоциации. Продолжайте объединять вентральные промежуточные мозги из дополнительных эмбрионов в той же пробирке до тех пор, пока общее количество не будет соответствовать экспериментальным требованиям.

Чтобы рассечь вентральный спинной мозг, держите эмбрион в положении лежа так, чтобы голова была обращена к передней части микроскопа. Придерживайте его одной парой пинцетов и введите кончик другой пары в нераскрытую каудальную часть четвертого желудочка. Откройте остальную часть заднего мозга и спинного мозга дорсально по всей рострокаудальной длине эмбриона. Разрежьте дорсальную ткань, начиная с четвертого желудочка и продвигаясь к центральному каналу каудального спинного мозга, используя щипцы в качестве ножниц.

Затем держите эмбрион одним набором пинцетов и отщипните лоскут тыльной ткани с каждой стороны другой парой. Удалите вентральный спинной мозг, используя нож для микродиссекции, чтобы проколоть прямо ниже GFP-положительного SMN, поднимая вентральный спинной мозг пилообразными движениями с обеих сторон.

Разрежьте спинной мозг поперечно по верхней границе нижней конечности, а шейный поясничный отдел удалите. Разрежьте поперечно прямо над C1, где выступает первый GFP-положительный передний рог. Поместите вентральный отдел спинного мозга дорсальной стороной вверх и удерживайте его, прижимая GFP-отрицательную ткань между GFP-положительными столбиками SMN с помощью пинцета.

Удалите оставшуюся прикрепленную мезенхиму, DRG и дорсальный спинной мозг, обрезав обе стороны GFP-положительного столбика SMN ножом для микродиссекции. С помощью пипетки P1000 соберите рассеченную вентральную ткань спинного мозга с минимальным HBSS и поместите ее в промаркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра, заполненную средой для вскрытия. Храните его на льду до диссоциации и продолжайте собирать вентральные спинные мозги из дополнительных эмбрионов в той же трубке.

Добавьте соответствующий объем раствора папаина в каждую из микроцентрифужных пробирок с препарированными образцами тканей. Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, перемешивая пробирки каждые 10 минут движением пальцев.

После инкубации аккуратно разрастите каждую суспензию восемь раз с помощью пипетки P200. Центрифугируйте его при 300 умноженных на г в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточные гранулы соответствующим объемом раствором ингибитора овомукоидов альбумина путем осторожного пипетирования вверх и вниз. Повторите центрифугирование. Затем осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000. Ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме диссекционной среды. Отфильтруйте суспензии через 70-микрометровые клеточные фильтры.

Затем используйте сортировку FACS для выделения GFP-положительных клеток, препарированных из CN3, CN4 и SMN. Разбавляют изолированные клеточные суспензии средой для культивирования моторных нейронов, предварительно нагретой до 37 градусов Цельсия до соответствующей плотности, и добавляют 200 микролитров суспензии в лунку 96-луночного планшета, покрытого PDL-ламинином. Культивируйте нейроны в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом, обновляя среду для культивирования моторных нейронов каждые пять дней.