Очистка клеток-предшественников эндотелия CD31⁺ с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток

Возьмите адгезивную культуру эндотелиальных клеток-предшественников или ЭПК, предшественников микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга.

Культура, полученная путем дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, содержит ЭПК, положительные на поверхностный маркер CD31 и контаминирующие CD31-отрицательные клетки.

Инкубируйте с помощью диссоциативного реагента, чтобы отделить клетки, и отфильтруйте для получения одноклеточной суспензии.

Добавьте среду для нейтрализации ферментов, центрифугуйте для удаления надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки в буфере.

Инкубируйте с блокирующим реагентом для ингибирования клеточных Fc-рецепторов, предотвращая неспецифическое мечение.

Добавьте флуорофор-конъюгированное антитело, специфичное к CD31, и инкубируйте для мечения EPC.

Центрифугируйте и выбросьте несвязанные антитела. Инкубируют с комплексами антител, содержащими одно антитело, которое связывается с флуорофорами.

Введите магнитные наночастицы с полимерным покрытием и инкубируйте, позволяя наночастицам связываться со вторым антителом комплекса.

С помощью магнитного поля изолируйте клетки, связанные с наночастицами.

Выбросьте суспензию с немечеными CD31-отрицательными клетками и повторно суспендируйте очищенные клетки в среде. CD31-положительные ЭПК готовы к последующим анализам.

На 5-й день культивирования клеток-предшественников эндотелия отсадите среду из лунок и добавьте в каждую лунку по 1 миллилитру диссоциационного реагента. Выдерживайте тарелку от 6 до 8 минут при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью микропипетки диссоциируйте и разделите клетки, затем пропустите клеточную суспензию через 40-микрометровый клеточный фильтр для фильтрации в 50-миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров среды DMEM/F-12.

Чтобы остановить реакцию пищеварения, добавьте среду DMEM/F-12/10 10 до отметки 50 миллилитров. Тщательно пипетируйте и оставьте 10 микролитров для подсчета клеток. Центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку при 200 г в течение 5 минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия, чтобы гранулировать клетки. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 10 миллилитрами среды DMEM/F-12/10.

Переложите клеточную суспензию в свежую 15-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия, чтобы снова гранулировать клетки. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфер потока 1. Затем добавьте блокирующий реагент FcR в соотношении 1 к 100 и инкубируйте в течение 5 минут. Затем добавьте разбавленный флуоресцеин изотиоцианат в соотношении 1 к 200 или меченное FITC антитело CD31.

Выдерживают суспензию в течение 30 минут в темноте при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. В конце инкубации добавьте к образцу 10 миллилитров проточного буфера 1, а для анализа проточной цитометрии оставьте 10 микролитров суспензии для анализа проточной цитометрии с целью определения фракции CD31-положительных клеток. Центрифугируйте клетки при 200 г в течение 5 минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. После центрифугирования суспендировать клетки раствором проточного буфера 1

Далее добавьте 5 микролитров отборочного коктейля FITC на 100 микролитров клеточной суспензии. Раствор тщательно перемешать с помощью пипетирования и выдержать в темноте в течение 15 минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Далее добавьте 5 микролитров магнитных наночастиц на 100 микролитров клеточной суспензии. Хорошо пипеткой смешайте смесь, и выдержите в темноте 10 минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия.

Перенесите клеточную суспензию в проточную цитометрическую пробирку объемом 5 миллилитров, и добавьте проточный буфер 1, чтобы получить общий объем 2,5 миллилитров. Затем поместите пробирку проточной цитометрии в магнит на пять минут. Непрерывным движением инвертируйте магнит и сцеживайте клеточную суспензию, содержащую немеченые клетки на основе антител FITC-CD31. Удерживайте магнит и трубку в перевернутом положении в течение 2–3 секунд, а затем удалите остатки жидкости.

Отсадите все капли с края трубки, прежде чем вернуть трубку в вертикальное положение. Извлеките пробирку проточной цитометрии из магнита и добавьте 2,5 миллилитра проточного буфера 1, чтобы промыть оставшиеся CD31-положительные клетки. Аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз, два или три раза, чтобы снова суспендировать их. Затем поместите проточную трубку в магнит на пять минут.

Повторите промывку не менее четырех раз, чтобы удалить немеченые клетки FITC-CD31 из пробирки. Снимите проточную трубку с магнита и восстановите очищенные CD31-положительные клетки в нужном количестве подходящей среды. Резервируйте две аликвоты суспензии объемом 1 мкл, одну для подсчета клеток, а вторую для проведения анализа проточной цитометрии с целью оценки чистоты CD31-положительных клеток в образцах постмагнитной активированной сортировки клеток.