Получение церебральных органоидов переднего мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Начните с луночного планшета с низким уровнем прикрепления, содержащего индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки или ИПСК в среде стволовых клеток с добавлением ингибитора рокиназы.

Ингибиторы проникают в клетки, блокируют ферменты рокиназы и поддерживают жизнеспособность клеток. Это способствует образованию агрегатов iPSC.

Замените среду средой для стволовых клеток, чтобы обеспечить рост агрегатов. Переложите их в чашку для культуры с низким уровнем прикрепления с кортикальной индукционной средой.

Компоненты этой среды заставляют ИПСК дифференцироваться в нейроэктодермальные клетки, предшественники нервов.

Переложите каждый нейроэктодермальный агрегат на пленку с неглубокими лунками.

Замените среду матрицей базальной мембраны и инкубируйте для обеспечения затвердевания матрицы и захвата заполнителей.

Перенесите эти встроенные в матрицу агрегаты в чашку, содержащую кортикальную индукционную среду, и инкубируйте с перемешиванием.

Со временем нейроэктодермальные клетки используют факторы дифференцировки и развиваются в нейроэпителиальные клетки.

Измените среду на среду для дифференцировки органоидов, что позволит клеткам созревать в более специализированные типы клеток, образуя церебральный органоид, напоминающий кору переднего мозга.

Для получения агрегатов плюрипотентных стволовых клеток, когда культуры стволовых клеток достигают конфлюенции от 70% до 90%, добавьте 500 микролитров реагента для диссоциации клеток в одну лунку из шестилуночного культурального планшета для отделения клеток.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, которые адаптированы к условиям монослойной культуры, являются хорошим типом клеток для получения агрегатов, поскольку они менее подвержены стресс-индуцированной гибели клеток во время процедуры диссоциации и агрегации.

Через 5-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия осторожно постучите по пластине и используйте 2 миллилитра DMEM/F-12, чтобы промыть клетки со дна лунки. Полученную клеточную суспензию переложите в 15-миллилитровую коническую пробирку, и доведите объем клеточного раствора до 10 миллилитров с большим количеством среды DMEM/F-12.

После подсчета перенесите 4,5 умножить на 10 на треть клеток на совокупность плюрипотентных стволовых клеток в новую 15-миллилитровую пробирку и соберите клетки центрифугированием. Ресуспендируйте гранулу в соответствующем объеме плюрипотентной среды стволовых клеток, дополненной 50 микромолярным ингибитором ROCK, чтобы получить 4,5 х 10³ клеток на 150 микролитров средней концентрации.

Затем добавьте 150 микролитров клеток в отдельные лунки 96-луночной U-образной нижней пластины с низким уровнем крепления и поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Для мониторинга индукции передней нейроэктодермы используйте микроскоп тканевой культуры, чтобы внимательно наблюдать за морфологическими изменениями агрегатов плюрипотентных стволовых клеток каждый день при малом увеличении.

В 1-й день следует наблюдать агрегаты клеток с четкими границами. На 2-й день осторожно отсадите примерно 2/3 среды, не нарушая клеточные агрегаты на дне каждой лунки, и замените выброшенную среду 100 микролитрами свежей плюрипотентной среды стволовых клеток.

Через четыре-шесть дней, когда клеточные агрегаты достигнут диаметра от 350 до 450 микрометров и обнаружат гладкие края, используйте модифицированный наконечник пипетки объемом 100 микролитров для переноса до 20 агрегатов в одну 6-сантиметровую культуральную пластину с низким уровнем прикрепления, содержащую 5 миллилитров кортикальной индукционной среды.

Заменяйте кортикальную индукционную среду свежей средой один раз в три дня, ежедневно контролируя морфологию агрегатов в соответствии с целью 4x. После четырех-пяти дней пребывания в корковой индукционной среде края клеточных агрегатов должны начать светлеть на поверхности, что указывает на нейроэктодермальную дифференцировку, и должна проявиться радиальная организация псевдослоистого эпителия.

Чтобы встроить нейроэктодермальные агрегаты в матричный каркас, заполните экстракт базальной мембраны льдом на два-три часа. Пока экстракт оттаивает, с помощью стерильных ножниц разрежьте пластиковую парафиновую пленку на один квадрат размером 4 на 4 сантиметра на 16 органоидов и поместите каждый кусок пленки на пустой лоток для микропипетки объемом 100 микролитров.

Прижмите парафиновую пленку кончиком пальца в перчатке, чтобы появились небольшие ямочки, и очистите пленку 70% этанолом. После УФ-облучения в закрытом стерильном шкафу биобезопасности в течение 30 минут используйте модифицированный наконечник для пипетки объемом 100 микролитров с отверстием от 1 и 1/2 до 2 миллиметров, чтобы перенести каждый клеточный агрегат в одну ямочку в пленке.

Когда все агрегаты будут перенесены, используйте неразрезанный наконечник для пипетки объемом 100 микролитров, чтобы осторожно аспирировать среду из каждой ямочки, и добавьте 40 микролитров неразбавленного экстракта базальной мембраны к каждому клеточному агрегату.

Будьте осторожны, чтобы не повредить органоиды при грубых манипуляциях или аспирации в кончик пипетки, так как это приведет к повреждению развивающегося нейроэпителия.

С помощью наконечника пипетки расположите агрегаты в середине каждой капли, а с помощью стерильных щипцов аккуратно перенесите лист пластиковой парафиновой пленки в 10-сантиметровую чашку Петри. Поместите блюдо в инкубатор на 15 – 20 минут.

Пока экстракт застывает, добавьте 5 миллилитров свежей среды для индукции коры головного мозга в одну шестисантиметровую чашку для культуры с низким прикреплением. В конце инкубации переверните лист парафиновой пленки и с помощью стерильных щипцов аккуратно выдавите до 16 полимеризованных капель в каждую 6-сантиметровую посуду. Затем верните агрегаты в инкубатор для клеточных культур.

На следующий день перенесите чашки для органоидных культур на качающийся шейкер для клеточных культур, наклоненный под углом 5 градусов со скоростью 14 об/мин, в инкубаторе для клеточных культур с ежедневным световым микроскопическим мониторингом до тех пор, пока агрегаты не достигнут интересующей стадии дифференцировки.