Выделение стволовых клеток, полученных из жировой ткани, из периаортальной жировой ткани мыши
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:52 мин • July 8th, 2025
Возьмем собранные трансгенные периаортальные жировые ткани мыши, содержащие флуоресцентные белки, экспрессирующие жировые стволовые клетки, происходящие от клеток нервного гребня, или НКК.
Добавьте питательную среду и пропустите через мясорубку.
Переложите измельченную салфетку с питательной средой в трубочку. Механически диссоциируйте фрагменты.
инкубировать. Коллагеназа в среде переваривает внеклеточный матрикс ткани, высвобождая стволовые клетки, адипоциты и фибробласты.
Добавьте сыворотку, содержащую среду, чтобы остановить активность коллагеназы. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую адипоциты.
Повторно суспендируйте элементы в среде и отфильтруйте, чтобы удалить заполнители.
Центрифугируйте фильтрат и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в буфере для лизиса эритроцитов для лизирования эритроцитов.
Добавьте буфер, содержащий сыворотку, чтобы остановить лизис. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
Снова суспендируйте ячейки в буфере.
Выполняйте сортировку клеток, активируемых флуоресценцией, для выделения флуоресцентных стволовых клеток.
Выделенные стволовые клетки могут быть использованы для дальнейших экспериментов.
Переложите собранную жировую ткань в новую микроцентрифужную пробирку объемом 2 миллилитра, содержащую 1 миллилитр свежеприготовленной среды для пищеварения, и с помощью хирургических ножниц измельчите ткани. Перелейте тканевую кашицу в 50-миллилитровую пробирку, содержащую 9 миллилитров свежей среды для пищеварения, и используйте пипетку объемом 1 миллилитр для растирания тканей 10 раз.
Когда будет получен однородный раствор, инкубируйте пробирку в течение 30-45 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 100 оборотах в минуту, проверяя каждые 5-10 минут, чтобы предотвратить переваривание. Когда при осторожном закручивании трубки можно наблюдать светло-желтый гомогенный раствор жировой ткани, остановите пищеварение с помощью 5 миллилитров HDMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. После тщательного перемешивания центрифугируйте образец жировой ткани.
Фракция стромальных сосудистых клеток будет видна в виде коричневатой гранулы. Ресуспендируйте гранулу в 10 миллилитрах питательной среды, и отфильтруйте клеточную суспензию через клеточное сетчатое фильтр толщиной 70 микрометров.
Соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования и аккуратно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов. Переложите суспензию в 15-миллиметровую трубку. Через 10 минут остановить реакцию двумя центрифугациями в 10 миллилитрах PBS, дополненных 1% фетальной бычьей сывороткой.
После второго центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах питательной среды на льду, а клетки соберите с помощью окончательного центрифугирования. Затем повторно суспендируйте клетки в 5 миллилитрах буфера FACS для подсчета.
Для создания культуры NCADSC после их выделения с помощью FACS в соответствии со стандартными протоколами поместите клетки с концентрацией 5 x 10 3 клеток на см2 в каждую лунку, 12-луночный культуральный планшет в полную культуральную среду при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 20-24 часа. На следующий день промойте клетки 37 Цельсием PBS, а культуру подкормите свежей питательной средой.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол выделения, культивирования и индукции адипогенной дифференцировки стволовых клеток, полученных из жировой ткани, которые происходят из нервного гребня (NCADSCs), из периаортальной жировой ткани мышей. В методе используются трансгенные мыши, экспрессирующие флуоресцентные белки в клетках нервного гребня, что позволяет точно идентифицировать и сортировать NCADSCs для последующего применения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Изоляция и культивирование клеток
- Исследование жировой ткани
Теоретическая часть
- Стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSCs), являются ценным ресурсом для регенеративной медицины.
- ADSCs, происходящие из нервного гребня, обладают уникальными свойствами и особенностями развития.
- Изоляция чистых популяций NCADSCs требует специфических методов маркировки и сортировки.
- Периаортальная жировая ткань мыши служит источником этих стволовых клеток.
Цель исследования
- Продемонстрировать воспроизводимый протокол выделения флуоресцентно меченых NCADSCs из периаортальной жировой ткани мыши.
- Обеспечить эффективное культивирование и экспансию отсортированных NCADSCs.
- Обеспечить возможность дальнейшего применения, включая адипогенную индукцию и функциональные исследования.
Используемые методы
- Сбор периаортальной жировой ткани от трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках нервного гребня.
- Механическое измельчение и ферментативное переваривание (коллагеназой) жировой ткани для высвобождения стромально-васкулярных клеток.
- Фильтрация и лизис эритроцитов для очистки клеточной суспензии.
- Сортировка клеток с помощью метода FACS для изоляции флуоресцентных NCADSCs.
- Культивирование отсортированных NCADSCs в полной среде при стандартных условиях.
Основные результаты
- Эффективное выделение флуоресцентно меченных NCADSCs из периаортальной жировой ткани мыши.
- Удаление адипоцитов и эритроцитов позволяет получить очищенную фракцию стромально-васкулярных клеток.
- Метод FACS позволяет проводить селекцию стволовых клеток, производных нейрального гребня, для последующего культивирования.
- Выделенные NCADSCs могут быть экспансированы in vitro для дальнейшего использования в экспериментах.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод выделения и культивирования NCADSCs из жировой ткани мыши.
- Флуоресцентное мечение и FACS обеспечивают высокую чистоту стволовых клеток, производных из нервного гребня.
- Данный метод применим для последующих исследований в области биологии стволовых клеток и изучения жировой ткани.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Выделение стволовых клеток, производных от жировой ткани и нейрального гребня (NCADSCs), из периаортальной жировой ткани мышей позволяет проводить валидацию мишеней в моделях метаболических и сосудистых заболеваний. Флуоресцентное мечение и очистка методом FACS обеспечивают воспроизводимую систему для снижения рисков при изучении механизмов действия терапии стволовыми клетками. Данный подход повышает прогностическую достоверность доклинического скрининга за счет обеспечения клеточной гомогенности и прослеживаемости линий дифференцировки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать вклад стволовых клеток, происходящих из нервного гребня, в гомеостаз и патологию жировой ткани.
- Практическая ценность: обеспечивает получение очищенной популяции клеток с флуоресцентной меткой для получения стабильных результатов экспериментов.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность определения мишеней за счет выделения определенной стромально-васкулярной фракции для функциональных анализов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: создание стандартизированного жизнеспособного источника клеток для адипогенной дифференцировки и скрининга лекарственного ответа.
- Практическая ценность: обеспечение воспроизводимости анализа за счет удаления contaminating-фибробластов и адипоцитов с помощью FACS.
- Масштабируемость: возможность экспансии клональных линий NCADSC для высокопроизводительного тестирования соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет связать поведение стволовых клеток in vitro с функциональной значимостью периаортальной жировой ниши in vivo.
- Механистическое снижение рисков: позволяет оценить адипогенный потенциал и нецелевую дифференцировку в модели с отслеживанием клеточных линий.
- Доклиническая модель: обеспечивает возможность тестирования метаболических регуляторов в контексте сосудисто-жирового интерфейса применительно к конкретным заболеваниям.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Рабочий процесс изоляции вписывается в период от раннего этапа поиска до перехода к доклиническим исследованиям, обеспечивая определенный клеточный исходный материал для последующей функциональной валидации и поиска перспективных соединений.
- Открытийная биология: Обеспечивает проверку гипотезы о роли стволовых клеток нейрального гребня в фиброзе и воспалении жировой ткани.
- Скрининг: Позволяет получить очищенную популяцию адгезивных клеток, готовых к воздействию соединений и фенотипическому анализу.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку эффективности дифференцировки и скорости пролиферации после изоляции.
- Трансляционные исследования: Связывает клеточное поведение с сосудисто-жировым взаимодействием в моделях атеросклероза и ожирения.
- Корпоративное повторное использование: Создает банковскую, генетически прослеживаемую линию стволовых клеток для многократного использования в рамках различных программ по изучению метаболических заболеваний.
Операционный и корпоративный эффект
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет выделения генетически определенного подмножества стволовых клеток из гетерогенной жировой ткани.
- Практическая ценность: Стандартизирует исходный материал с помощью очистки методом FACS, что повышает согласованность результатов между экспериментами.
- Стратегическая ценность: Повышает надежность принятия решений о продолжении или прекращении исследований за счет минимизации вариативности исходных стромально-васкулярных клеток.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет проводить приоритизацию соединений, модулирующих стволовые клетки, с учетом рисков на основе ответов, специфичных для конкретной клеточной линии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями мышей, проведения ферментативного переваривания и сортировки клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера.
- Зависит от наличия коллагеназы, оборудования для FACS и стерильной инфраструктуры для культивирования клеток.
- Необходима стандартизация времени переваривания и лизирующих буферов для обеспечения стабильного выхода стромально-васкулярной фракции.
- Адаптация метода для других жировых депо может потребовать оптимизации параметров диссоциации.
- Ограничено специфичностью экспрессии трансгена; фоновая флуоресценция может потребовать использования контролей гейтирования.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Выделение и дифференциация полученных из жировой ткани стволовые клетки из свиных подкожного жирового ТКАНЕЙ
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение, пролиферация и дифференциация стволовых клеток, полученных из адипозы макаки-резуса
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и культивирование стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, с помощью инновационного безксеногенного метода терапии человека
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция жировой ткани иммунных клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение мышиных полученных из жировой ткани микрососудистых Фрагментов как васкуляризация единицы для тканевой инженерии
Похожие видео
0 Просмотры
Расширение и адипогенез Индукция адипоцитов-предшественников из периваскулярной жировой ткани, изолированной магнитоактивированной сортировкой клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция, Культура и адипогенная индукция нейронных Креста Оригинальные жировые стволовые клетки из периаортных жировой ткани
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Подготовка адипозы Клетки-предшественники из мыши Эпидидимальные жировые ткани
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026