Почему проверка нулевой гипотезы важна для выделения энтеральных глиальных клеток?

Проверка нулевой гипотезы гарантирует, что наблюдаемые различия в выходе или чистоте глиальных клеток являются статистически значимыми, что обеспечивает надежную валидацию мишени и снижает вероятность ложноположительных результатов на ранних этапах поиска.

Как изоляция независимой переменной вписывается в рабочий процесс с глиальными клетками?

Изоляция таких переменных, как состав буфера или время инкубации, позволяет группам исследователей оптимизировать выход и чистоту клеток, что способствует совершенствованию разработки анализов и механистических исследований в процессе поиска и разработки препаратов.

Что позволяют измерить количественные зависимые переменные в анализах глиальных клеток?

Количественные измерения выхода, жизнеспособности и чистоты клеток позволяют объективно сравнивать экспериментальные условия, обеспечивая воспроизводимость и надежность последующего скрининга.

Почему требования к репликации имеют критическое значение для кросс-функциональных исследований глиальных клеток?

Воспроизводимость гарантирует, что результаты выделения и культивирования глиальных клеток будут согласованными в разных группах, что способствует межфункциональному сотрудничеству и интеграции данных в многоцентровых программах НИОКР.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением протоколов изоляции глиальных клеток?

Командам необходимы статистические инструменты для оценки выхода, чистоты и жизнеспособности клеток, что позволяет принимать обоснованные решения по оптимизации протокола и определять готовность к более широкому внедрению в рамках исследований и разработок.

Выделение кишечных глиальных клеток из подслизистой оболочки и собственной пластинки мыши

JoVE Encyclopedia of Experiments

Нейронауки

0 просмотров • 4:52 мин • July 8th, 2025

Возьмите сегмент тонкой кишки мыши, ранее лишенный продольной мышцы и миентерального сплетения, слои, содержащие кишечные нейроны, и глиальные клетки.

Разрежьте ткань и поместите ее в буфер, содержащий ЭДТА. Инкубация с укачиванием.

ЭДТА разрушает межклеточные соединения, отделяя слизистую оболочку эпителия от нижележащей собственной пластинки и подслизистой оболочки, слоев соединительной ткани, содержащих кишечные глиальные клетки.

Делайте пипетку несколько раз, чтобы вытеснить эпителиальные клетки.

Процедите через сетчатое фильтр и выбросьте проточный.

Перенесите ткань в неферментативный буфер диссоциации и инкубируйте ее с покачиванием. Диссоциативный буфер разрыхляет собственную пластинку и подслизистый внеклеточный матрикс, отделяя клетки.

Проводите пипетку несколько раз для дальнейшей диссоциации клеток.

Профильтруйте через сетчатое фильтр, чтобы собрать клетки.

Центрифугируйте и повторно суспендируйте клетки в буфере.

Возьмите лунки, покрытые адгезионным белком, содержащие глиальную питательную среду, и накройте клетки планшетами.

Покрытие способствует клеточной адгезии, в то время как факторы роста избирательно способствуют пролиферации глиальных клеток, создавая собственную пластинку и культуру подслизистых глиальных клеток.

Чтобы удалить слизистую оболочку эпителия, сначала с помощью тонких ножниц разрежьте кишечник примерно на 0,5-сантиметровые кусочки и соберите кусочки в 30 миллилитрах ледяного раствора EDTA/HEPES/DPBS. Раскачивайте тканесодержащий раствор при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут со скоростью примерно 60 наклонов в минуту.

Предварительно смочите 5-миллилитровую пластиковую пипетку, пипетируя буфер EDTA/HEPES/DPBS вверх и вниз один раз, а затем используйте предварительно увлажненную пипетку для растирания ткани и буферную суспензию 20 раз, чтобы сместить слизистую оболочку эпителия.

Соберите ткань, вылив смесь через 100-микронный нейлоновый клеточный фильтр, и с помощью игольчатых щипцов поместите ткань, оставшуюся в фильтре, в новую 50-миллилитровую коническую центрифужную трубку, содержащую 30 миллилитров ледяного ЭДТА/HEPES/DPBS. Повторите инкубацию EDTA/HEPES/DPBS во второй раз, покачивая ткань при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут со скоростью примерно 60 наклонов в минуту, чтобы удалить дополнительную слизистую оболочку эпителия.

Проведите щадящую растирание с помощью предварительно увлажненной 5-миллилитровой пипетки. Ткань будет иметь тенденцию прилипать к внутренней части пипетки по мере удаления большей части эпителия.

На этом этапе требуется щадящая растирание, так как кишечные глиальные клетки более хрупкие.

Соберите ткань после второй инкубации, вылив смесь через 100-микронное сетчатое фильтр с нейлоновыми ячейками, и выбросьте поток. Второй проточный должен быть заметно менее мутным, чем первый. Повторяйте 10-минутную инкубацию ЭДТА до тех пор, пока раствор не станет почти прозрачным.

Перенесите ткань из нейлонового ситечка в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую 5 миллилитров коммерчески доступного раствора для восстановления клеток. Затем покачивайте от 25 до 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Аккуратно растирайте 10 раз, чтобы отделить кишечные глиальные клетки от собственной пластинки, затем профильтруйте через фильтр 40 микрон и соберите фильтрат в чистую 50-миллилитровую пробирку.

Промойте салфетку на капроновом фильтре 1 миллилитром DPBS. Выбросьте салфетку и перенесите от 5 до 6 миллилитров фильтрата в чистую 15-миллилитровую коническую центрифужную пробирку. Вращайте фильтрат со скоростью 2000 раз больше g в центрифуге с качающимся ведром в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Ресуспендируйте гранулу, содержащую глиальные клетки, по крайней мере в 1 миллилитр буфера для ресуспензии, осторожно пипетируя гранулу вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 500 микролитров, не вводя пузырьков. Наконец, наносите пластины на кишечные глиальные клетки, добавляя 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета, покрытого ламинином, или 100 микролитров в каждую лунку 12-луночного планшета, содержащего глиальную питательную среду.