Способ выделения нейроваскулярных единиц из головного мозга крысы

Начните с холодной стеклянной ступки, содержащей кортикальную ткань мозга крысы, которая является самым внешним слоем мозга.

Добавьте буфер микрососудов головного мозга или BMB, содержащий ингибиторы протеазы.

Теперь двигайте пестиком вверх и вниз, чтобы диссоциировать ткань.

Это возбуждение высвобождает нервно-сосудистые единицы, или NVU, состоящие из микрососудов, перицитов, нейронов и глиальных клеток. Ингибиторы протеазы блокируют высвобождающиеся протеазы, защищая микрососуды.

Переложите эту смесь в трубочку.

Добавьте густой раствор полисахарида. Используйте вихрь, чтобы равномерно перемешать раствор с другим содержимым.

центрифуга. Плотные полисахариды способствуют осаждению NVU, которые плотнее, чем остатки тканей.

Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте NVU в BMB, содержащем ингибитор протеазы и раствор полисахарида.

Используйте вихрь для перемешивания содержимого.

Повторите процесс центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить остатки мусора.

Ресуспендируйте NVU в BMB и сохраните их для дальнейшего анализа.

Поместите кортикальную ткань мозга в охлажденную стеклянную ступку. Затем добавьте 5 миллилитров BMB с коктейлем ингибитора протеазы. Используя верхний силовой гомогенизатор, вставьте пестик в ступку и гомогенизируйте ткань мозга с помощью 15 движений вверх и вниз со скоростью 3700 оборотов в минуту. Затем разлейте гомогенат по пробиркам с маркировкой. Между пробами используйте 70% этанол для очистки пестика.

Чтобы провести центрифугирование, добавьте 8,0 мл 26% раствора декстрана в каждую меченую центрифужную пробирку, содержащую гомогенат мозга. Дважды переверните трубку, а затем тщательно переверните образец. Проведите вихревую обработку каждого образца под разными углами, чтобы обеспечить тщательное смешивание раствора гомогената мозга с 26% раствором декстрана. Центрифугируйте образцы при 5000 г и 4 градусах Цельсия в течение 15 минут.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 5,0 мл BMB с коктейлем ингибиторов протеазы. Затем перебейте гранулу в вихрь, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Затем добавьте 8,0 миллилитров 26% декстрана в каждую центрифужную пробирку и вихрь, как показано выше. Затем снова центрифугируйте образцы.

С помощью вакуумной колбы и стеклянной пипетки аспирируйте надосадочную жидкость и следите за тем, чтобы гранула, содержащая микрососуд мозга, не была нарушена. Повторно суспендируйте гранулу в BMB с ингибитором протеазы, а затем еще два раза 26% декстрана. После окончательного центрифугирования добавьте 5,0 миллилитров BMB в каждую гранулу и вихрь для ресуспендирования образца.