Методика забора и диссоциации ганглиев дорсальных корешков для нейрональных культур

Возьмите участок позвоночного столба крысы и разделите его, чтобы удалить спинной мозг.

Отделите ганглии дорсальных корешков, или DRG, скопление нейронов, окруженных сателлитными глиальными клетками, или SGC.

Поместите DRG в питательную среду. Удалите нервные корешки, чтобы уменьшить загрязнение SGC.

Обработайте коллагеназой для разрушения тканевого матрикса и промойте для удаления ферментов.

Вводите трипсин для нарушения межклеточных связей. Добавьте сыворотку, содержащую белки, которые дезактивируют трипсин.

Добавьте питательную среду и механически диссоциируйте ткань. Отфильтруйте суспензию для выделения отдельных клеток и центрифугируйте для удаления остатков тканей.

Повторно суспендируйте клетки, чтобы наложить их на среду с градиентом плотности, и центрифугируйте.

Нейроны с более высокой плотностью располагаются на дне, облегчая разделение SGC.

Ресуспендируйте нейроны в культуральной среде. Перенесите их на культуральный субстрат, хорошо покрытый слоем, позволяющий прикрепить клетки.

Добавка с факторами роста нервов для выживания нейронов.

Чтобы получить нейроны DRG после забора спинного мозга, начните с удаления любых дорсальных частей, а затем с помощью стерильных и острых хирургических ножниц разделите позвоночный столб пополам по продольной оси, обнажив ткань спинного мозга. Разрежьте позвоночный столб на два меньших сегмента ниже уровня грудной клетки, а затем с помощью тонких щипцов аккуратно удалите всю ткань спинного мозга, стараясь не вытянуть и не удалить корни DRG, которые выглядят как белые нити, выходящие непосредственно из каналов.

После того, как вся основная ткань будет удалена, используйте очень тонкие щипцы, чтобы вытянуть весь корень DRG, проникая глубоко в позвоночные каналы и стараясь не повредить корни ганглий. Поместите DRG в чашку Петри площадью 60 квадратных миллиметров, содержащую от 3 до 4 миллилитров среды F-12 от Ham, дополненной антибиотиками. Затем под препарирующим микроскопом используйте стерильные щипцы и скальпель, чтобы удалить лишние нервные корешки, окружающие ганглии, чтобы уменьшить загрязнение сателлитных клеток.

Далее переложите DRG в чашку Петри площадью 35 квадратных миллиметров, содержащую 1,8 миллилитров свежей среды F-12, и добавьте 200 микролитров исходного раствора коллагеназы типа 4. Инкубируйте DRG в течение одного часа, а затем осторожно отсасывайте среду с помощью стеклянной пипетки, стараясь не отсасывать и не повредить DRG.

Повторите шаг коллагеназы и промойте DRG средой F-12. После второй промывки добавьте в клетки 1,8 миллилитра среды F12 и 200 микролитров трипсина, удалив трипсин и добавив 1 миллилитр среды, дополненной 500 микролитрами FBS, чтобы остановить ферментативную реакцию. Затем аспирируйте среду и аккуратно промойте DRG средой F-12 три раза, чтобы удалить все следы сыворотки.

Теперь накормите клетки 2 миллилитрами свежей среды F-12 и с помощью стеклянной пипетки осторожно перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку. Проводите пипеткой вверх и вниз от 8 до 10 раз, чтобы мягко диссоциировать нейроны, а затем дайте грануле накопиться на дне пробирки. Когда гранула осядет, переложите надосадочную жидкость в новую пробирку, и добавьте в гранулу 2 миллилитра свежей среды F12, повторяя механическую диссоциацию и перенос среды до тех пор, пока суспензия не станет однородной.

Затем растирают клеточную суспензию три-четыре раза, а затем фильтруют полученную гомогенизированную суспензию через 100-микронный клеточный фильтр в новую 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте клетки в 15-миллилитровой пробирке. Пока они вращаются, медленно пипеткой пипетка со свежеприготовленным 15% бычьим сывороточным альбумином вниз по внутренней стороне 15-миллилитровой пробирки, держащейся под углом 45 градусов, чтобы создать постепенный белковый след, используя цифры на пробирке в качестве ориентира для формирующейся дорожки.

Затем аспирируйте надосадочную жидкость из клеток, сохраняя последние 500 микролитров для повторного суспендирования гранулы, и медленно дозируйте клетки по белковому следу в новую пробирку. После повторного вращения клеток повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре модифицированной среды BS и засейте клетки в небольшом объеме среды в 24-луночный планшет на два часа. Когда клетки прикрепятся, добавьте свежую среду BS с добавлением 50 нанограммов на миллилитр фактора роста нервов.