JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:51 мин • July 8th, 2025
Начнем с мозга мышей с нервными, ненейронными и иммунными клетками во внеклеточном матриксе мозга или ВКМ.
Измельчите ткань и повторно суспендируйте ее в питательной среде.
Перенесите эти фрагменты ткани в пробирку и обработайте их коллагеназой и ферментами ДНКазы-I.
Коллагеназа переваривает ВКМ, высвобождая отдельные клетки, в то время как ДНКаза-I разрушает свободную ДНК, предотвращая слипание клеток.
Затем добавьте ЭДТА для инактивации ферментов коллагеназы.
Добавьте питательную среду. Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.
Добавьте раствор градиента плотности и питательную среду к клеточной грануле, создавая слой градиента низкой плотности.
Смешайте, а затем покройте раствор градиентом высокой плотности, чтобы установить разницу в плотности.
Центрифугируйте на низкой скорости, чтобы отделить иммунные клетки на границе раздела, с более легкими клеточными остатками наверху и более тяжелыми нейрональными и глиальными клетками внизу.
Удалите верхний слой, соберите иммунные клетки и перенесите их в другую пробирку.
Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клетки в среде, образуя одноклеточную суспензию для последующего применения.
Насыпьте ткань головного или спинного мозга со средой в 100-миллиметровую чашку Петри, и с помощью щипцов переместите ткань на дно. Измельчите мозговую ткань стерильным бритвенным лезвием и соберите ткань на дне пластины. Добавьте в чашку Петри 3 миллилитра RPMI с добавлением 10% FCS, затем с помощью 10-миллилитровой серологической пипетки ресуспендируйте ткань в среде и перенесите ее в 15-миллилитровую коническую трубку.
Добавьте в ткань коллагеназу I типа и ДНКазу I и инкубируйте пробирки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. Переворачивайте трубочки каждые 15 минут, чтобы тщательно перемешать ткань с ферментами. После инкубации добавьте ЭДТА в каждую пробирку до конечной концентрации 0,01 моляра и инкубируйте пробирки еще пять минут, чтобы инактивировать коллагеназу.
Добавьте 9 миллилитров RPMI, дополненных 10% FCS, в каждую пробирку, затем центрифугируйте пробирки при 450 г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Используйте пастеровскую пипетку с вакуумом для аспирации надосадочной жидкости, стараясь не касаться клеточной гранулы.
Добавьте 3 миллилитра 100% стокового изотонического раствора градиента плотности в клеточную гранулу. Затем добавьте дополнительный фильтрующий материал RPMI 10% FCS, чтобы довести конечный объем до 10 миллилитров, и повторно суспендируйте клеточную гранулу. Переверните и хорошо перемешайте трубку. Затем вставьте серологическую пипетку с 1 миллилитром 70% исходного раствора изотонического градиента плотности на дно пробирки.
Медленно подкладывайте раствор, стараясь не образовывать пузыри. Извлеките серологическую пипетку из пробирки, следя за тем, чтобы она не нарушила градиент. Центрифугируйте пробирку при 800 г в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, затем аспирируйте надосадочную жидкость, включая слой миелиновых остатков, пока в пробирке не останется от 2 до 3 миллилитров.
С помощью пипетки объемом 1 миллилитр соберите слой клеток с градиентом плотности от 30% до 70% и перенесите его в новую 15-миллилитровую пробирку. Добавьте среду RPMI 10% FCS, чтобы довести конечный объем до 15 миллилитров, затем центрифугируйте ячейки при 450 г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
В данной статье подробно описывается метод выделения иммунных клеток из тканей мозга мыши. Процесс включает ферментативное расщепление внеклеточного матрикса с последующим центрифугированием в градиенте плотности для разделения типов клеток.
Выделение иммунных клеток из тканей головного мозга мыши позволяет снизить механические риски при валидации мишеней в нейроиммунологии, предоставляя релевантную заболеванию систему для функционального анализа. Этот подход поддерживает фенотипический скрининг и разработку анализов для препаратов, модулирующих ЦНС, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска. Данный метод способствует согласованию трансляционных биомаркеров и обеспечению непрерывности доклинических моделей при иммуноопосредованных неврологических показаниях.
Данный метод представляет выделение иммунных клеток как критически важный начальный этап исследования, который позволяет идентифицировать перспективные соединения и проводить доклиническую валидацию в рамках программ по нейроиммунологии.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026