Выделение шванновских клеток из спинномозговых корешков мышей

Возьмите нервный корешок и нарежьте его небольшими кусочками.

Переложите в пробирку, содержащую пищеварительные ферменты, и инкубируйте.

Фермент переваривает внеклеточный матрикс.

Добавьте среду, содержащую сыворотку, чтобы остановить пищеварение.

Повторно пипетируйте содержимое, затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Снова суспендируйте гранулу.

Пропустите суспензию через ситечко, чтобы удалить непереваренную ткань. Инкубируйте собранные клетки в тарелке.

Фибробласты и шванновские клетки или СК прикрепляются к пластине и делятся.

Удалите неприкрепленные ячейки. Промойте прикрепленные клетки фосфатным буфером.

Добавьте пищеварительные ферменты, чтобы ослабить чувствительные к пищеварению СК. Остановите пищеварение с помощью среды.

Полностью отсоедините SC, добавив носитель.

Переложите ячейки в пробирку и центрифугу. Отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в средах, специфичных для СК.

Перенесите клетки в непокрытую пластину и инкубируйте.

Любые оставшиеся фибробласты прилипнут, оставляя СК во взвешенном состоянии.

Перенесите суспензию на пластину с матричным покрытием.

Инкубация для прикрепления и деления шванновских клеток.

Разрежьте нервы на кусочки по 3-5 миллиметров с помощью ножниц. Добавьте 1 миллилитр 0,25% трипсина, и переложите нервные кусочки в 5-миллилитровые центрифужные пробирки. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18-20 минут. Далее, чтобы остановить пищеварение, добавьте от 3 до 4 миллилитров DMEM, содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки. Аккуратно пипеткой вверх и вниз, около 10 раз. Центрифугируйте при 800 раз g в течение 5 минут.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте осадок в дозе от 2 до 3 миллилитров DMEM с добавлением 10% FBS. Отфильтруйте клеточную суспензию через фильтр на 400 меш, а затем используйте суспензию для инокуляции 60-миллиметровой чашки Петри. Выдерживайте чашки Петри от 4 до 5 дней при температуре 37 градусов Цельсия в присутствии 5% углекислого газа.

Когда культура достигнет 90% конфлюенции, промойте клетки один раз с помощью 1X PBS. Затем, чтобы переварить шванновские клетки, добавьте 1 миллилитр 0,25% трипсина при температуре 37 градусов Цельсия на 60-миллиметровую посуду. Через 8-10 секунд при комнатной температуре остановите пищеварение, добавив 3 миллилитра DMEM с добавлением 10% FBS. Чтобы отделить шванновские клетки, осторожно подуйте на клетки пипеткой.

Проверьте с помощью микроскопа, что клетки отсоединены. Затем соберите среду, в которой находятся шванновские клетки, и центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте осадок в 3 миллилитрах среды. Используйте суспензию для инокуляции некодированных 60-миллиметровых чашек Петри и инкубируйте чашки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-45 минут. Перенесите среду, в которую будут содержаться шванновские клетки, в среднюю чашку, покрытую поли-L-лизином, и инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 дней.