Препарирование эндотелиальных трубок головного мозга из паренхиматозных артериол мыши

Закрепите мозг мыши брюшной стороной вверх в чашке с кремниевым полимерным покрытием, содержащей буфер.

Рассеките участок ткани от полушария вокруг средней мозговой артерии (MCA), при этом верхний сегмент ткани выходит за пределы точки ветвления от Виллисового круга.

Закрепите салфетку MCA стороной вверх.

Удалите мягкую мозговую оболочку с артериолами, которые ответвляются от MCA.

Закрепите мягкую мозговую оболочку артериолами. Рассеките артериолу и удалите окружающие ткани. Отбросьте все дистальные ветви.

Инкубируйте артериолу в протеолитическом ферментном коктейле, чтобы облегчить частичное переваривание сегмента.

Замените ферменты буфером и перенесите расщепленный сегмент в камеру, содержащую буфер, на предметном столике микроскопа, оснащенном пипеткой для растирания.

Многократно пипетируйте артериолы, чтобы удалить ослабленные адвентиции и гладкомышечные клетки, в результате чего получится неповрежденная трубка, содержащая эндотелиальные клетки артериол.

Поместите вентральную сторону мозга вверх в камеру с раствором для холодной диссекции, чтобы изолировать паренхиматозные артериолы. Чтобы изолировать паренхиматозные артерии, закрепите изолированный мозг стальными штифтами и раствором для холодной диссекции в чашке Петри, содержащей покрытие из силиконового полимера глубиной более 50 сантиметров.

Разрежьте прямоугольник ткани мозга с обоих полушарий острыми и выровненными ножницами для препарирования вокруг MCA, при этом следя за тем, чтобы верхняя часть сегмента ткани находилась за точкой разветвления от круга Виллиса. Закрепите мозговую ткань в чашке стальными булавками МКА вверх. Аккуратно сделайте неглубокий надрез возле штифтов, и удалите пиа небольшими щипцами, аккуратно отшелушивая от одного конца к другому.

Тщательно закрепите изолированную пиа с паренхиматозными артериолами, ответвленными от МКА, в чашке с помощью штифтов и тщательно препарируйте паренхиматозные артериолы. Отрежьте все оставшиеся дистальные ветви и убедитесь, что артериола чистая без салфетки. Используйте эту чистую интактную артериальную для ферментативного пищеварения. В качестве альтернативы разрежьте каждую артерию на две части для ферментативного переваривания, чтобы при желании подготовить эндотелиальные трубки.

Для частичного переваривания артериолярных сегментов поместите интактные артериолярные сегменты в 1 миллилитр диссоциационного раствора в 10-миллилитровую стеклянную пробирку, содержащую папаин, дитиоэритрит, коллагеназу и эластазу. Инкубируйте артериальные сегменты при температуре 34 градуса Цельсия в течение 10-12 минут.

Чтобы изолировать артериальную эндотелиальную трубку, поместите пипетку для растирания, прикрепленную к инжектору микрошприца, в раствор диссоциации в камере и расположите ее близко к одному концу сегмента переваренного сосуда. Установите норму в диапазоне от 1 до 3 нанолитров в секунду на контроллере насоса для щадящей продолжительности обработки. Сохраняя от 100 до 200-кратного увеличения, выводите артериальный сегмент в пипетку, а затем вводите инъекции для диссоциации адвентиции и гладкомышечных клеток. Растирайте сегмент сосуда до тех пор, пока все гладкомышечные клетки не будут диссоциированы и только эндотелиальные клетки не останутся в виде неповрежденной трубки.