Создание модели культуры провоспалительных органов для моделирования раннего заболевания межпозвоночных дисков

Возьмите бычий хвост.

Удалите вышележащие ткани и позвоночные отростки, затем разрежьте поперек для получения сегментов.

Определите межпозвоночный диск или МВД, расположенный между пластинками роста и концевыми пластинами позвонков.

Разрежьте с обеих сторон IVD и поместите его в посуду с марлей, смоченной в буфере для поддержания жизнеспособности тканей.

Соскребите всю прикрепленную ткань позвонка и измерьте высоту IVD.

Промыть с помощью буфера для удаления остатков крови и провести дезинфекцию IVD в буфере, содержащем антибиотики.

Поместите ИВД в камеры биореактора, содержащие среды.

Среда в физиологической группе имеет высокий уровень глюкозы, в то время как в патологической группе среда с низким содержанием глюкозы вызывает недостаток питательных веществ.

Поместите камеры в биореактор.

Для физиологического МПД ежедневно применяйте щадящую нагрузку. При патологическом ИВД применяйте интенсивную нагрузку в более высоком темпе ежедневно.

Между ежедневными нагрузочными тестами дайте возможность ИВД восстановиться в средах.

После всех загрузочных процедур измерьте высоту ИВД.

Уменьшенный рост при патологических ИВД свидетельствует о дегенеративном и провоспалительном состоянии.

Начните с тщательного промывания всего бычьего хвоста водой из-под крана, чтобы удалить грязь и шерсть с поверхности. Затем погрузите хвост в 1% раствор бетадина на 10 минут для дезинфекции поверхности. С помощью скальпеля No 20 удалите мягкие ткани из хвостового отдела позвоночника, чтобы облегчить идентификацию межпозвоночных дисков или IVD.

Удалите остистые и поперечные отростки позвонков с помощью плоскогубцев для удаления кости. Разрежьте поперечно костными плоскогубцами середину тела каждого позвонка, чтобы получить отдельные подвижные сегменты, затем поместите собранные подвижные сегменты в чашку Петри с марлей, смоченной в растворе Рингера.

Найдите IVD и позвонки, осторожно перемещая двигательные сегменты. Затем определите расположение пластины роста, коснувшись и найдя выпуклую сторону костной торцевой пластины. Охладите полотно ленточной пилы раствором Рингера и с его помощью сделайте два параллельных разреза в ростовой пластине IVD, по одному с каждой стороны.

Перенесите ИВД в чистую чашку Петри с чистой марлей, смоченной раствором Рингера. Соскребите тело позвонка и пластину роста с помощью лезвия скальпеля, оставив торцевую пластину нетронутой. Расположите две поверхности ровно и параллельно для процедуры загрузки и перенесите соскобленные IVD в свежую чашку Петри с марлей, смоченной раствором Рингера.

Измерьте высоту и диаметр диска с помощью штангенциркуля. Затем очистите сгустки крови в кости позвонков раствором Рингера с помощью системы струйного промывания зубов. Дезинфицируют ИВД в PBS и 10% пенициллин-стрептомицин, с встряхиванием в течение 15 минут. Промойте антибиотики высокой концентрации PBS и 1% пенициллина стрептомицина.

Перенесите диски в камеры ИВД, содержащие 5 миллилитров питательной среды ИВД, и поместите их в систему биореактора с инкубатором при температуре 37 градусов Цельсия с влажностью 85% и углекислым газом 5%. Культивируйте диски в течение четырех дней в биореакторной системе, поддерживая различные условия загрузки в соответствии с экспериментальными группами.

В физиологической контрольной группе культивирование ИВД с высоким содержанием глюкозы в среде с использованием протокола нагрузки от 0,02 до 0,2 мегапаскаль и 0,2 Герц в течение двух часов в сутки. В патологической группе культивировали ИВД с низким содержанием глюкозы в среде с использованием протокола нагрузки от 0,32 до 0,5 мегапаскаль и 5 Герц в течение двух часов в сутки.

Между нагрузочными процедурами поместите ИВД в шестилуночные планшеты с 7 мл питательной среды ИВД для свободного восстановления отека. Ежедневно измеряйте высоту диска штангенциркулем после периода свободного набухания и после динамической нагрузки в течение всего эксперимента.