Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши в сетевую популяцию нейронов

Засейте эмбриональные стволовые клетки мыши в чашке с низким уровнем прикрепления, содержащей среды для дифференцировки.

Инкубируйте при вращении, чтобы облегчить клеточную агрегацию и дифференцировку в нейронную линию.

Переложите заполнители в трубку и дайте им осесть под действием силы тяжести. Выбросьте носители.

Повторно суспендируйте и перенесите агрегаты в исходную чашку, содержащую дифференцировочную среду с добавлением ретиноевой кислоты.

Ретиноевая кислота индуцирует экспрессию нейрональных генов, запуская дифференцировку в нейральные клетки-предшественники.

Переложите агрегаты в трубку. Удалите среду и добавьте трипсин, чтобы диссоциировать агрегаты.

Добавьте ингибитор для нейтрализации трипсина.

Пипетка повторяется до получения однородной клеточной суспензии. Отфильтруйте суспензию, чтобы удалить агрегаты.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в среде.

Высадите клетки на чашку с полимерным покрытием, чтобы облегчить адгезию клеток.

Извлеките носитель. Добавьте свежие среды, содержащие факторы роста, чтобы способствовать созреванию нейронов и сформировать сетевую популяцию нейронов.

Дифференцировка ЭСК в нейроны начинается во время обычного прохождения клетки. Диссоциируйте ЭСК, как и раньше, но включите дополнительную пластину для дифференцировки нейронов. Перелейте 350 микролитров клеточной суспензии в 10-сантиметровую чашку с низким уровнем прикрепления, содержащую 25 миллилитров дифференцировочной среды.

Поместите чашку на орбитальный шейкер со скоростью от 30 до 45 оборотов в минуту внутри инкубатора для культивирования тканей при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и инкубируйте в течение 48 часов. Через 48 часов с помощью 25-миллилитровой пипетки перенесите дифференцирующие клеточные агрегаты в 50-миллилитровую коническую трубку.

Сразу после этого добавьте в чашку Петри 25 миллилитров свежей среды для дифференцировки. Дайте заполнителям осесть в течение двух-пяти минут, образуя видимую гранулу глубиной от одного до двух миллиметров. Осторожно отсасывайте среду, игнорируя отдельные клетки или небольшие агрегаты, все еще находящиеся во взвешенном состоянии, и с помощью пипетки P1000 перенесите клеточную гранулу обратно в чашку Петри. Верните блюдо в вращающийся шейкер в инкубатор. Через 48 часов повторите процедуру смены носителя. На этот раз добавьте 30 миллилитров дифференцировочной среды, дополненной шестью микромолярами полностью транс-ретиноевой кислотой.

Сформированная гранула теперь будет иметь глубину от двух до четырех миллиметров. После инкубации клеток, как и раньше, повторите процедуру смены среды с добавлением ретиноевой кислоты в последний раз. На этом этапе гранула будет иметь глубину от четырех до восьми миллиметров.

На следующий день подготовьте поверхности для гальванического покрытия, как указано в письменной части протокола. Во второй половине дня в день нанесения ванны разморозьте по 5 миллилитров предварительно аликвотированной среды для трипсинизации NPC и 0,1% ингибитора трипсина сои при температуре 37 градусов Цельсия. Затем с помощью 25-миллилитровой пипетки перенесите дифференцирующие агрегаты с культуральной пластины в 50-миллилитровую коническую пробирку.

Дайте агрегатам отстояться в течение трех-пяти минут, а затем осторожно отсадите среду, не нарушая гранулы. Далее промойте гранулу от 5 до 10 миллилитров PBS, а после того, как заполнители осядут, отсадите PBS и повторите промывку. После второй промывки PBS добавьте в гранулу 5 миллилитров среды для трипсинизации NPC и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, осторожно перелистывая трубку два-три раза во время инкубации.

Далее добавляем в клетки 5 миллилитров 0,1% ингибитора соевого трипсина и быстро перемешиваем путем инвертирования. Затем осторожно растирайте клетки от 10 до 15 раз с помощью пипетки объемом 10 миллилитров до получения относительно однородной клеточной суспензии. Медленно отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр толщиной 40 или 70 микрон, расположенный поверх 50-миллилитровой конической трубки.

Затем, когда вся суспензия будет отфильтрована, добавьте в фильтр 1 миллилитр среды N2, чтобы промыть оставшиеся клетки через ситечко. Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте в течение шести минут при 200-кратном избежении.

После аспирации среды, не нарушая гранулы, растирают в 2 миллилитрах среды N2, затем добавляют среду N2 до общего объема 10 миллилитров. Центрифугируйте в течение пяти минут при 200-кратном изг. Аспирируйте среду и повторите процесс промывки гранул, снова суспендируя гранулу в 10 миллилитрах среды N2.

Удалите аликвоту из клеток, и посчитайте с помощью гемоцитометра, а затем повторите центрифугирование. Ресуспендируйте клетки в среде N2 до конечной концентрации 1x 10^{7 клеток на} миллилитр и поместите в тарелку с плотностью от 150 000 до 200 000 клеток на квадратный сантиметр в чашках, приготовленных при DIV минус 1, и поместите в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия. Поддерживайте ESN в соответствии с инструкциями в письменном протоколе.