Метод выделения ядер из ненейрональных клеток в зубчатой извилине гиппокампа

Возьмите зубчатую извилину из мозга мыши в холодном гомогенизационном буфере.

Механически диссоциируют для высвобождения нейронов, глии и стволовых клеток.

Мягкое моющее средство буфера проникает в клетки, высвобождая ядра и другие органеллы.

Отфильтруйте гомогенат, чтобы удалить остатки тканей. Затем центрифугируете, удалите органеллы и повторно суспендируйте в гомогенизационном буфере, чтобы лизировать все неповрежденные клетки.

Снова центрифугируйте, удалите надосадочную жидкость, содержащую высвобождающиеся органеллы, и ресуспендируйте ядра в промывном буфере.

Фильтр для удаления мусора, центрифуга и удаление надосадочной жидкости.

Введите флуоресцентный краситель ДНК для маркировки всех ядер и флуорофор-конъюгированное антитело, которое связывается с нейронным ядерным антигеном, или NeuN, помечая ядра нейронов.

Используя сортировку ядер, активированных флуоресценцией, идентифицировать агрегаты с более высокой интенсивностью флуоресценции окрашивания ДНК и более высокими свойствами рассеяния, разделяя отдельные ядра.

Анализируйте отдельные ядра, разделяя NeuN-положительные ядра нейронов и выделяя NeuN-отрицательные ядра, принадлежащие глии и стволовым клеткам.

Гомогенизируйте ткань 10 ударами рыхлого пестика А, а затем 15 ударов плотного пестика В. Переложите гомогенат в предварительно охлажденную 15-миллилитровую пробирку. Промойте гомогенизатор Dounce 1 миллилитром холодного HB, и соедините его с той же тюбиком.

Добавьте в 3 миллилитра 15 миллилитров HB, и выдержите 5 минут на льду. Дважды перемешайте эту суспензию ядер, осторожно перевернув трубку. Используя 0,5 миллилитра HB, предварительно намочите крышку 70-микрометрового фильтра, помещенную над 50-миллилитровой пробиркой. Затем процедите ядра суспензии перед промыванием клеточного фильтра 0,5 миллилитрами HB.

Далее снимите сетчатое фильтр с ячеек и центрифугируйте пробирку в центрифуге с качающимся ведром при температуре 500 г в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость. Аккуратно суспендируйте гранулу в 4 миллилитрах HB с помощью пипетки P1000.

После пяти минут инкубации на льду центрифугируйте суспензию при 500 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте гранулу в 3 миллилитрах промывочного материала. Используйте 0,5 миллилитра промывочного материала, чтобы предварительно намочить крышку фильтра размером 35 микрометров над 50-миллилитровой пробиркой. Затем процедите ядра суспензии, пипетируя 0,5 миллилитра суспензии за один раз с помощью пипетки P1000.

Промыв крышку ситечка 0,5 миллилитрами промывочного средства, поместите трубку на лед. Переложите фильтрат в новую 15-миллилитровую пробирку, и центрифугируйте ее в течение 5 минут и 4 градусов Цельсия при 500 г. Выбросьте надосадочную жидкость, а гранулу снова суспендируйте в 3 миллилитрах промывочного материала.

Повторите центрифугирование и повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре промывочной среды с мышиным анти-Neu и конъюгированным антителом AlexaFlour488 и 1 микрограммом на миллилитр DAPI. Инкубируйте реакцию в течение 45 минут на льду в темноте.

Для сортировки флуоресцентно активированных ядер или FANS перенесите иммуноокрашенную суспензию ядер в 5-миллилитровую пробирку и поместите ее на лед до начала процедуры проточной цитометрии.

Переведите образцы на вихрь в течение трех секунд с умеренной интенсивностью, прежде чем поместить пробирки в прибор FACS.

Чтобы получить данные о суспензии окрашенных ядер, установите ворота в высоту DAPI и область DAPI, чтобы исключить клеточный мусор и агрегированные ядра. Затем установите затворы в области логарифмического бокового рассеяния или SSC и области прямого рассеяния бревна или FSC, чтобы отделить отдельные ядра от оставшегося окрашенного DAPI агрегата или клеточного мусора.

Затем изолируйте NeuNAF488-отрицательную популяцию, установив ворота для зоны анти-NeuNAF488 и FSC.

После анализа отсортируйте анти-NeuNAF488-отрицательную популяцию в 1,5-миллилитровой пробирке, заполненной 50 микролитрами промывочной среды, используя стратегию гейтирования.