Клеточная судьба перепрограммирования половых клеток нематоды в нейроны

Возьмем генетически модифицированные бактерии на среде для роста нематоды.

Бактерии несут плазмиду с геном хроматин-регулирующего фактора нематоды.

Среда содержит индуктор, который запускает экспрессию трансгенной РНК-полимеразы из бактериального генома, который транскрибирует ген фактора, регулирующего хроматин, в дцРНК.

Добавьте к этому личинки трансгенных нематод, несущие ген фактора транскрипции, вызывающий судьбу нейрона, под промотором теплового шока.

При употреблении в пищу бактериями проглоченная дцРНК генерирует миРНК, которая подавляет экспрессию хроматин-регулирующего фактора, способствуя перепрограммированию судьбы клетки.

Через зародышевые клетки родителей миРНК передается потомству.

Подавление экспрессии хроматин-регулирующего фактора в половых клетках потомства, на что указывает фенотип выступающей вульвы, позволяет перепрограммировать их.

Примените тепловой шок к потомству, активируя промотор теплового шока и экспрессируя фактор транскрипции, вызывающий судьбу нейронов, который запускает дифференцировку нейронов, превращая половые клетки в нейроны.

Нейроны экспрессируют трансгенный флуоресцентный репортерный белок, облегчая микроскопическую визуализацию.

Вручную перенесите 50 червей L4 на репликацию на планшет NGM RNAi. Используйте платиновую проволоку. Червей L4 можно узнать по белому пятну примерно на полпути вдоль их брюшных сторон. Теперь инкубируйте червей при температуре 15 градусов Цельсия в темноте в течение примерно семи дней. IPTG светочувствительна.

Когда потомство F1 достигнет стадий L3 и L4, отделите его от более крупных и толстых родительских животных. На этом этапе проведите скрининг F1 на фенотип выступающей вульвы, который указывает на то, что РНК-интерференция против lin-53 была успешной. Активность РНК-интерференции также может привести к летальности, которая увеличивается выше 15 градусов по Цельсию. Чтобы активировать G1 и вызвать преобразование зародышевых клеток в нейроны у потомства F1, подвергните червей тепловому шоку в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. Используйте вентилируемый инкубатор, так как он обеспечивает более эффективный тепловой шок.

После теплового шока инкубируйте тарелки при температуре 25 градусов Цельсия на ночь в темноте. Важно избегать индуцирования гиперэкспрессии Q1 тепловым шоком до того, как животные достигнут середины стадии L3. Это может привести к экспрессии белка Q1 в нецелевых тканях. На следующий день установите источник флуоресцентного света и фильтр GFP, чтобы исследовать животных на наличие трансгенной флуоресценции в области средней части тела.