Выделение иммунных клеток из сосудистых сплетений мышей

Расположите мозг мыши тыльной стороной вверх.

Под микроскопом отделите полушария головного мозга. Оттяните кору, а затем гиппокамп, чтобы обнажить боковые желудочки и третий желудочек.

Соберите два боковых сосудистых сплетения. Это богатые иммунными клетками структуры мозга, которые выстилают боковые желудочки как длинная вуаль.

Соберите сосудистое сплетение третьего желудочка, представляющее собой короткую структуру с зернистой поверхностью.

Отделите мозжечок, чтобы обнажить четвертый желудочек.

Соберите сосудистое сплетение четвертого желудочка, представляющее собой длинную шаровидную структуру с зернистой поверхностью.

Поместите все сосудистые сплетения в трубку с буферным физиологическим раствором для поддержания целостности тканей.

Добавьте раствор пищеварительного фермента и инкубируйте с перемешиванием.

Фермент разрушает внеклеточный матрикс и разрыхляет клетки.

Добавьте подходящий буфер для инактивации фермента.

Центрифуга для отстаивания клеток. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в свежем буфере для дальнейшего анализа.

Для начала поместите мозг, расчлененный спинной стороной мыши C57 black 6 вверх, в чашку Петри и поместите чашку ниже объективов бинокулярных луп. Удерживая мозг на месте с помощью щипцов, вставьте два конца другой пары щипцов вниз через среднюю линию между полушариями.

С помощью щипцов оттяните кору с мозолистым и гиппокампом от перегородки, обнажив боковой желудочек и часть третьего желудочка. Определите латеральное сосудистое сплетение как длинную вуаль, выстилающую боковой желудочек и расширяющуюся с обоих концов. Затем с помощью двух концов тонких щипцов собрать латеральное сосудистое сплетение. Будьте внимательны, чтобы собрать треугольную заднюю часть, скрытую задней складкой гиппокампа.

Далее потяните кору с мозолистым телом и гиппокампом контралатерального полушария, от перегородки, чтобы обнажить весь третий желудочек и противоположный боковой желудочек. С помощью тонких щипцов соберите третье сосудистое сплетение, идентифицированное как короткая структура с зернистой поверхностью. Затем соберите другое боковое сосудистое сплетение.

Затем вставьте два конца щипцов между мозжечком и средним мозгом и отделите мозжечок от моста и мозгового вещества, чтобы обнажить четвертый желудочек. Затем определите четвертое сосудистое сплетение как длинную шаровидную структуру с зернистой поверхностью, которая линьирует четвертый желудочек от латерального правого конца до левого конца между мозжечком и мозговым веществом. С помощью тонких щипцов соберите четвертое сосудистое сплетение.

После инкубации всех собранных сосудистых сплетений с коллагеназой IV осторожно пипетируйте вверх и вниз около 10 раз, чтобы завершить диссоциацию. Затем заполните пробирку до 1,5 миллилитров буфером MACS, чтобы остановить внутривенную активность коллагеназы. Далее центрифугируйте клетки и выбросьте надосадочную жидкость перед промыванием клеток 1,5 миллилитрами буфера MACS. После добавления соответствующих компенсационных шариков и растворов антител инкубируйте образцы на льду в течение 30-45 минут, защищая их от воздействия света. Затем наполните пробирки 1,5 миллилитрами буфера MACS.