Получение смешанной культуры глиальных клеток из мозга неонатальной мыши

Начните с мозга неонатальной мыши и перенесите его в пробирку, содержащую раствор протеолитического фермента.

Ферменты разрушают внеклеточный матрикс ткани и инициируют диссоциацию клеток.

Многократно промойте переваренную ткань питательной средой для удаления ферментов.

Используйте пипетку большего диаметра, чтобы многократно перемещать ткань через пипетку, чтобы диссоциировать ее на более мелкие фрагменты.

Затем с помощью пипетки меньшего диаметра продолжайте диссоциацию фрагментов, создавая клеточную суспензию.

Отфильтруйте эту суспензию, чтобы удалить клеточные скопления и получить одноклеточную суспензию, содержащую первичные нейроны и смешанную популяцию глиальных клеток, включая микроглию и астроциты.

Посейте клетки в колбу для культивирования, содержащую питательную среду, и инкубируйте для повышения их адгезии.

Со временем отсутствие факторов роста нейронов в среде вызывает гибель нейронов.

Замените отработанный носитель на свежий. Глиальные клетки используют питательные вещества и размножаются, создавая смешанную глиальную культуру астроцитов и микроглии.

Перенесите мозг в 50-миллилитровую трубку, содержащую 2 миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА, и инкубируйте в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Промойте мозг свежей средой для роста, добавляя и удаляя среду. После завершения промывки добавьте 2 миллилитра питательной среды на каждый мозг и гомогенизируйте путем растирания мозга.

Когда мозговая ткань не становится меньше, переходите на пипетку с меньшим отверстием. В конце титрования, когда суспензия станет прозрачной без видимых кусочков, пропустите суспензию через клеточное сетчатое фильтр толщиной 70 микрон, чтобы создать одноклеточную культуру.

Затем нанесите пипеткой от 8 до 9 миллиметров питательной среды в колбы T75, по две колбы на мозг, и добавьте 1 миллилитр гомогената мозга в каждую колбу. Выращивайте клетки до изоляции на 16-й день.