Дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в клетки, подобные микроглии

Начните с многолуночного планшета с низкой адгезией, содержащего индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки в эмбриоидном теле или среде EB.

Центрифуга для отстаивания клеток. Инкубируются для стимулирования пролиферации и агрегации клеток, формируя эмбриоидные тельца.

Регуляторы клеточной линии способствуют дифференцировке клеток в миелоидные предшественники.

Соберите эти БЭ и перенесите их на край внеклеточного матрикса или пластины с покрытием ECM.

Замените среду примитивным предшественником макрофагов или средой для дифференцировки PMP и осторожно перемешайте. Инкубация для облегчения прикрепления БЭ к ECM.

Замените половину среды и выработайте.

Факторы роста кроветворения заставляют миелоидные предшественники дифференцироваться в примитивные предшественники макрофагов, которые отделяются от БЭ и появляются в среде.

Соберите эти PMP и раскрутите ячейки вниз. Ресуспендируйте их в среду для дифференцировки микроглии.

Посадите эти клетки в многолуночный планшет, покрытый ламинином, и инкубируйте.

PMP используют факторы дифференцировки и питательные вещества, дифференцируя их в микроглии, тип иммунных клеток мозга.

Для гальванических ячеек добавьте 100 микролитров разбавленных клеток на лунку в 96-луночный планшет с круглым дном с низкой адгезией. Центрифугируйте планшет при 125-кратном g в течение трех минут и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение четырех дней.

На 2-й день с помощью многоканальной пипетки замените старую половину среды EB на свежую среду. Чтобы получить примитивные предшественники макрофагов или PMP, покройте лунки 6-луночного планшета, добавив 1 миллилитр ледяного раствора для покрытия матрицы. Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух часов или на ночь.

На 4-й день дифференцировки БЭ с помощью наконечника пипетки объемом 1 миллилитр перенесите БЭ в лунки, покрытые матригелевым покрытием. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы выбить EB из лунки. Затем держите пластину под наклоном, чтобы позволить EB осесть на краю скважины.

После того, как все БЭ устаканятся, аккуратно проведите пипетку и замените старую среду, сохраняя БЭ на краю лунки 3 миллилитрами свежеприготовленной полной среды PMP. Равномерно распределите ячейки в лунках, вручную перетасовывая пластины из стороны в сторону и задом наперед. Затем инкубируйте планшет в течение семи дней, чтобы позволить EB прикрепиться к дну лунки.

Через семь дней осмотрите БЭ под микроскопом светового поля при 4-кратном увеличении, чтобы убедиться, что они прикреплены к дну лунок. Выполните половинную замену среды, а на 21-й день замените полную среду на 3 миллилитра полной среды PMP.

На 28-й день ищите круглые клетки, называемые PMP в надосадочной жидкости. Затем соберите среду, содержащую PMP, с помощью 10-миллилитровой пипетки и автоматического дозатора, не нарушая БЭ.

Переложите ПМП в среде в 15-миллилитровую коническую пробирку. Центрифугируйте собранные PMP при 200-кратном g в течение четырех минут и аспирируйте надосадочную жидкость перед их ресуспендированием в 1-2 миллилитрах микроглии-подобных клеток или базальной среде IMG.

Затем посчитайте клетки на гемоцитометре, как описано ранее. Центрифугируйте остальные элементы и разбавьте PMP до нужной концентрации. Затем поместите клетки с плотностью^{10 5} клеток на квадратный сантиметр на планшеты, обработанные клеточными культурами, используя свежеприготовленную полную среду IMG.