Создание культуры глиальных клеток Мюллера, полученной из сетчатки мышей

Возьмем, к примеру, сетчатку мыши, содержащую глиальные клетки Мюллера, или MG-клетки, и нейроны.

Поместите их в диссоциативный раствор с пищеварительными ферментами и инкубируйте с легким покачиванием, чтобы обеспечить равномерное распределение ферментов.

Эти ферменты разрушают внеклеточный матрикс, отделяя отдельные клетки.

Проводите пипеткой по сетчатке вверх и вниз несколько раз, чтобы освободить клетки.

Добавьте ингибитор, чтобы остановить активность фермента, затем центрифугируйте.

Выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клетки в средах, содержащих фактор роста, специфичный для клеток MG.

Перенесите клетки в лунку и инкубируйте.

Со временем фактор роста в среде способствует росту и размножению MG-клеток, в то время как неделящиеся нейронные клетки погибают.

Извлеките носитель. Постирайте с помощью буфера для соли.

Инкубируйте с пищеварительным ферментом, чтобы отделить клетки от лунки.

Соберите клетки в пробирку, а затем центрифугируйте.

Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую мертвые нейронные клетки.

Ресуспендирование MG-клеток в среде для дальнейшего анализа.

Приготовьте смесь для диссоциации ДНКазы папапина, как описано в рукописи. Теперь с помощью пипетки для переноса с увеличенным наконечником возьмите сетчатку. Подождите, пока сетчатка осядет в нижней части кончика, и отпустите сетчатку, без чрезмерного HBSS, в трубку, содержащую смесь папаин-ДНКазы I.

Далее поместите трубку на орех в инкубатор и инкубируйте в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия и с 5% углекислым газом. Далее диссоциируйте клетки, тщательно пипетируя вверх и вниз пипеткой объемом 1 миллилитр. После того, как клетки будут диссоциированы, добавьте 275 микролитров ингибитора овомукоидной протеазы из набора для диссоциации папаина, чтобы нейтрализовать папаин, и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.

Поместите пробирки в центрифугу и вращайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 8 минут при относительной центробежной силе 300. Добавьте эпидермальный фактор роста к расчетному объему питательной среды, предварительно подогретой до 37 градусов Цельсия. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги.

Не прикасаясь к грануле на дне трубки, осторожно и целиком удалите надосадочную жидкость. Теперь ресуспендируйте клеточную гранулу 500 микролитрами питательной среды, обогащенной эпидермальным фактором роста. Затем перенесите клеточную суспензию в одну лунку маркированного 12-луночного планшета. Промойте пробирку еще 500 микролитрами питательной среды, обогащенной эпидермальным фактором роста, и добавьте ее в лунку.

Осторожно покачивайте пластину лунки. Затем поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с углекислым газом. Начните с проверки конфлюенции клеток от 90% до 100%. Далее удалите среду, и добавьте 1 миллилитр холодного HBSS для промывки лунки. Аккуратно покачайте пластину и удалите HBSS без каких-либо следов.

Позже добавьте 500 микролитров предварительно подогретого раствора, содержащего трипсин, чтобы отсоединить клетки от лунки. Осторожно покачивайте и инкубируйте в течение 2 минут в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. После перемещения планшета из инкубатора в шкаф биобезопасности отсасывайте трипсинсодержащий раствор при наклоне. Осторожно и медленно распределите его по лунке несколько раз, пока ячейки полностью не отделятся.

Далее переложите эту клеточную суспензию в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку, а пробирки поместите в центрифугу. Вращайте при 300 умноженных на g в течение 8 минут при температуре 4 градуса Цельсия и верните пробирки обратно в шкаф для биобезопасности. Удалите надосадочную жидкость, не прикасаясь к грануле. Теперь осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу, добавив 600 микролитров предварительно подогретой питательной среды и пипетируя вверх и вниз примерно от 30 до 40 раз.